Лазерно-индуцированный перенос гелевых микрокапель с микроорганизмами

Диссертационная работа посвящена разработке, оптимизации и практическому внедрению лазерной системы, позволяющей осуществлять перенос гелевых микрокапель, содержащих живые микроорганизмы, при заданных условиях газовой среды на различные акцепторные среды. В основе работы лежит принцип лазерно-индуцированного прямого переноса вещества LIFT (laser-induced forward transfer). В результате действия импульсного лазерного излучения на тонкий поглощающий слой на донорной прозрачной подложке происходит перенос малых объемов вещества. Возможности LIFT используются для целого ряда высокотехнологичных приложений: нанесение экранов из порошкового люминофора для дисплеев высокого разрешения, перенос крайне хрупких и чувствительных материалов органических тонкопленочных резисторов, органических светодиодов. Также возможности LIFT нашли применение для переноса и осаждения различных биоматериалов: белков, молекул ДНК, бактериальных и стволовых клеток. В настоящее время метод применяется для решения целого ряда медицинских задач, в частности, для тканевой инженерии. Отдельное направление LIFT связано с микробиологическими задачами, что связано с бурным развитием генетических технологий в последние десятилетия и с появлением новых методов секвенирования биополимеров, расширивших возможности для исследования микроорганизмов. Подавляющая часть микроорганизмов остается некультивируемой стандартными лабораторными методами. Поэтому одним из важнейших направлений современной микробиологии является поиск новых подходов к выделению, культивированию и позиционированию микроорганизмов. Возможное использование неизвестных ранее микроорганизмов может помочь в решении целого ряда глобальных задач от синтеза новых природных антибиотиков и производства биологически активных веществ с использованием новых продуцентов до создания банка микроорганизмов с целью сохранения биоразнообразия и для сохранения оригинальных штаммов микроорганизмов без изменений их первоначальных свойств. Для перечисленных задач в настоящее время предложены следующие направления, основанные на LIFT. Так, в биологической лазерной печати BioLP (Biological Laser Printing) применяются УФ-лазеры с длиной волны 248 нм, излучение которых является довольно жестким по отношению к биологическим клеткам. Поэтому научной группой ИФТ РАН был предложен метод лазерной инженерии микробных систем (ЛИМС), где перенос клеточного субстрата в геле осуществляется посредством лазера ближнего ИК-диапазона (1064 нм). Механизм процесса переноса заключается в том, что лазерное излучение, сфокусированное на поглощающей металлической пленке, на которой распределен гель с клетками, приводит к нагреванию пленки и возникновению быстро расширяющегося парогазового пузыря, при расширении которого возникают струи жидкости. Перенос малого количества геля с отдельными клетками позволяет получить чистые бактериальные культуры из сложных гетерогенных сред. За счет этого растет вероятность выделения отдельных ранее не культивируемых или трудно культивируемых микроорганизмов, чего не удается достигнуть, используя традиционные методы микробиологического посева. Несмотря на заявленные преимущества, существует целый ряд ограничений: в области лазерного воздействия возникают ударные акустические волны и высокие температуры, развиваются большие ускорения гелевых струй, из-за разрушения поглощающей пленки вместе с каплями переносятся металлические наночастицы, которые могут оказывать цитотоксическое воздействие, также многие микроорганизмы гибнут в кислородосодержащей среде. В рамках диссертационной работы была разработана лазерная система для печати гелевыми микрокаплями на основе импульсного иттербиевого волоконного лазера с длиной волны 1064 нм и длительностью импульса 8 нс. Данная система позволяет осуществлять перенос гелевых капель в контролируемых газовых условиях. Были найдены оптимальные параметры для переноса клеточных объектов в гелевых микрокаплях на различные акцепторные среды. Осуществлена комплексная оценка ряда физических факторов, которые возникают в процессе лазерного переноса живых микрообъектов в гелевых микрокаплях: импульсное давление, скачок температуры, ускорения гелевых струй, образующиеся наночастицы из материала поглощающих металлических пленок. При практической реализации представленной системы удалось показать, что лазерный перенос гелевых микрокапель позволяет увеличить разнообразие культивируемых микроорганизмов в сравнении со стандартными методами микробиологического посева, а также позволяет выделять монокультуры ранее не описанных или трудно культивируемых микроорганизмов из природных консорциумов. В частности, из сложного природного консорциума микроорганизмов был выделен штамм редкого рода Nonomuraea без использования специальных селективных сред. Также впервые осуществлен лазерный перенос и разделение устойчивой бинарной микробной культуры из термального источника. Выделенный новый штамм отнесен к новому классу с присвоением ему названия Tepidiforma bonchosmolovskayae.