Разработка новых ферментных препаратов с оптимизированным составом и изменёнными свойствами индивидуальных ферментов

Возобновляемая растительная биомасса является альтернативным источником сырья и энергии. Она является источником биотоплива (биоэтанол и биобутанол). Кроме того, переработка растительной биомассы позволяет получать разнообразные коммерчески востребованные продукты (этилен, органические кислоты, аминокислоты, сахарные спирты, фураны, сложные эфиры, алкены, алканы, акрилаты, полимеры, кормовые продукты). Важным этапом превращения биомассы в полезные продукты является гидролиз входящих в её состав полисахаридов (в первую очередь целлюлозы) в моносахариды с помощью ферментных препаратов, получаемых с использованием различных микроскопических грибов. Недостаточная активность таких ферментных препаратов является одним из существенных препятствий для масштабирования технологий биоконверсии растительной биомассы. Продуцентами наиболее эффективных многокомпонентных ферментных препаратов для деструкции целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) являются микроскопические грибы родов Trichoderma и Penicillium. Их целлюлолитические комплексы содержат в своем составе «классический» набор гидролаз трех типов: эндоглюканаз (ЭГ), целлобиогидролаз (ЦБГ) и β-глюкозидаз (БГЛ). Эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы и относительный состав продуктов её деструкции зависят от сбалансированности состава целлюлазного комплекса и уровня активности отдельных компонентов. Эффективность осахаривающей способности целлюлазных комплексов можно увеличить с помощью подбора оптимального состава ферментов комплекса, а также добавления в его состав новых ферментов, например полисахаридмонооксигеназы (ПМО). Для увеличения активности отдельных ферментов и улучшения их эксплуатационных характеристик активно применяются методы генетической и белковой инженерии, позволяющие вносить аминокислотные замены в структуру ферментов. Ранее в нашей лаборатории были получены мутантные формы ЦБГ1 и ЭГ2 с делецией одного из сайтов гликозилирования (ЦБГ1д и ЭГ2д). Эти мутации положительно повлияли на каталитические свойства ферментов, и проведённые предварительные испытания показали большую эффективность мутантных форм при гидролизе различного ЦСС. Добавление в ферментный комплекс гриба Penicillium verruculosum ЭГ1 из Trichoderma reesei так же способно положительно сказаться на осахаривающих свойствах комплекса. Данный фермент проявляет более высокую каталитическую активность и способен воздействовать на большее количество полимерных субстратов по сравнению с собственными эндоглюканазами гриба P.verruculosum. Целью данной работы являлась оптимизация состава комплекса гриба P.verruculosum и улучшение свойств его основных целлюлаз методами генетической инженерии, а именно: получение мутантных форм ЦБГ1д и ЭГ2д с увеличенной молекулярной активностью, получение препаратов, содержащих ЦБГ1д, ЭГ1 и ЭГ2д в разных комбинациях и определение среди них наиболее эффективного препарата, а также получить препарат вспомогательных ферментов (ПМО и БГЛ), чтобы использовать его как добавку к препарату основных целлюлаз при осахаривании ЦСС. Всё это в конечном счёте необходимо для получения препаратов с улучшенными каталитическими и операционными свойствами.