Комплексная стратегия изучения путей морфогенеза древесных in vitro и их регуляции на примере представителей рода Rhododendron

Показано, что процессы прямого органогенеза побегов de novo из проростков дикорастущего вида Rhododendron mucronulatum Turcz происходят за счет дедифференциации клеток тканей гипокотиля. С помощью световой микроскопии установлены локализация начальных делений клеток паренхимы и эпидермы и последующее формирование меристематических центров, развитие которых привело к прямой дифференциации примордиев адвентивных почек вдоль всей поверхности гипокотилей, особенно активной в зоне среза. Выявлены различия в тканевой локализации начальных этапов формирования структур de novo из листовых эксплантов R. mucronulatum и вечнозеленого сорта финской селекции Helsinki University. Хотя пути морфогенеза из листовых эксплантов у этих изучаемых объектов в целом сходны (регенерация побегов происходит прямым путем, наблюдается формирование эмбриоидоподобных структур), на ранних этапах процесса отмечены существенные различия. У листовых эксплантов вечнозеленого сорта Helsinki University под действием тидиазурона (ТДЗ) наблюдали деление прокамбиальных клеток, клеток эпидермы и верхних слоев паренхимы, в то время как у листовых пластинок R. mucronulatum начальные деления клеток отмечали только в эпидермальном слое. Установлено, что регенерация побегов из флоральных эксплантов R. dauricum L., индуцированная с помощью ТДЗ, происходит по прямому пути морфогенеза, в основе которого лежат два параллельных процесса: дедифференциация эпидермальных клеток цветоножки с последующим приобретением компетенции к морфогенезу; активация и развитие уже существующих меристем, находящихся в пазухах почечных чешуй, удаленных при изоляции эксплантов. Независимо от типа экспланта (проростков, листовых пластинок или флоральных органов) при ТДЗ-индуцированной регенерации наблюдаются значительные изменения морфологии побегов de novo, в частности формируются эмбриоидоподобные структуры, но так как с помощью гистологического анализа выявлено отсутствие как закладки корневых апексов, так и формирования биполярных структур на последующих стадиях, можно утверждать, что регенерация происходит путем адвентивного побегообразования.С целью создания новых морозоустойчивых сортов рододендронов путем расширения генетической базы изучаемых объектов использовали индукцию каллусогенеза из листовых эксплантов для стимуляции сомаклональной изменчивости. В качестве индукторов использовали различные концентрации регуляторов роста ТДЗ или ТДЗ в сочетании с 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д). Показано, что при индукции морфогенеза из листовых эксплантов Helsinki University в зависимости от комбинации и концентрации регуляторов роста происходили как каллусообразование, так и регенерация побегов. При культивировании листовых эксплантов R. mucronulatum на среде, содержащей 9 мкМ 2,4-Д + 1 мкМ ТДЗ, получен максимальный процент регенерации каллуса (100%). На всех средах, содержащих 2,4-Д, наблюдали только каллусогенез из листовых пластинок этого вида, а в присутствии ТДЗ без 2,4-Д - побегообразование. Выявлены генотипические различия морфогенных реакций in vitro при индукции непрямого органогенеза из листовых эксплантов изучаемых генотипов. Разработан эффективный протокол клонального микроразмножения перспективного дальневосточного вида R. mucronulatum из пазушных меристем с использованием ТДЗ. Испытаны два способа обработки одноузловых эксплантов: непосредственное культивирование на ТДЗ-содержащих средах (0,1; 0,25; 0,5; 1 и 2,5 мкМ) и импульсная обработка в растворах ТДЗ (7,5; 15 или 30 мкМ) с последующим культивированием на безгормональной среде. Длительное культивирование на ТДЗ-содержащих средах увеличило пролиферацию побегов R. mucronulatum, но ингибировало их элонгацию, а также способствовало развитию анатомических и морфологических нарушений. Использование четырехчасовой импульсной обработки ТДЗ, напротив, позволило не только увеличить частоту регенерации до 83 - 97%, но и стимулировать элонгацию побегов, сводя к минимуму проявление аномалий развития. Разработанная система регенерации R. mucronulatum, включающая импульсную обработку ТДЗ в высокой концентрации (30 мкМ), может быть использована в программах по сохранению этого вида, а также для селекции новых форм.