Генетическая и метаболическая инженерия микроорганизмов – продуцентов ключевых интермедиатов фармацевтических стероидов

Актуальными проблемами остаются разработка научно-практических основ биоконверсии природных и синтетических стероидов, изучение зависимости биоконвертируемости стероида от его структуры, метаболическая и генетическая инженерия штаммов-продуцентов, выявление высокоактивных штаммов и ферментных систем. Работа проведена по следующим направлениям: оценка биотехнологического потенциала мутантов Mycobacterium smegmatis mc2 155 с инактивированными геном fadD3; изучение катаболизма стеринов актинобактериями: выявление стерин-индуцируемых генов и контролирующих их транскрипционных факторов; определение таргетных генов-мишеней для метаболической инженерии; изучение геномики новых актинобактерий, перспективных для биотехнологического применения; создание и экспериментальная оценка микробных платформ для гетерологической экспрессии эукариотических белков стероидогенеза; изучение ферментных систем микромицетов, осуществляющих реакции оксифункционализации стероидных соединений. Проведен нокаутный мутагенез генов fadD3 и ipdA, ipdB штамма Mycolicibacterium smegmatis mc2 155. Сопоставительный анализ выявил преимущества делеционного мутанта по fadD3 в качестве продуцента изопреноидных соединений, являющихся ценными прекурсорами синтетических стероидных гормонов. Выявлены условия, обеспечивающие высокий выход целевых продуктов при высоких нагрузках фитостерина (40 – 100 г/л). Предложен биохимический механизм образования целевых изопреноидов, разработаны эффективные процедуры их выделения и очистки с получением кристаллических продуктов с чистотой не менее 95%. Результаты важны для создания новых схем синтеза высоковостребованных фармацевтических стероидов.Проведено секвенирование генома штамма S.hirsuta subsp. hirsuta ВКМ Ас-666, последовательность генома размером 7.55 млн. п.н. (содержание (G+C) - 71.4%) депонирована в NCBI Genbank. Выявлены кандидатные гены стероидного катаболизма. Результаты являются основой для регуляции метаболизма стероидов у термофильных актинобактерий и создания эффективных биокатализаторов, способных производить ценные биоактивные стероиды. На основании анализа результатов высокопроизводительного секвенирования мРНК штаммов Mycolicibacterium neoaurum ВКМ Ас-1815D и Mycolicibacterium sp. ВКМ Ас-1817D, выращенных в различных условиях индукции, выявлены стерин-индуцируемые гены, которые не контролируются известными транскрипционными регуляторами. Обнаружена нуклеотидная последовательность (motif_X), сходная с сайтом связывания транскрипционного фактора Rv0767c M. tuberculosis. Ортологом Rv0767c у штамма 1817D является транскрипционный фактор семейства TetR G155_05115, предположительно связывающийся с motif_X, названный нами KstR4. Выявлено 14 оперонов, предположительно контролируемых KstR4. Среди генов, контролируемых KstR4, - гены стероид-изомеразы, цитохромов P450, и др., предположительно, задействованные во второстепенных путях стероидного катаболизма у микобактерий.Осуществлено изучение полных транскриптомов культур Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д, выращенных в различных условиях индукции. Обнаружены новые кандидатные транскрипционные регуляторы, гены и опероны генов. Установлены различия наборов генов, увеличивающих экспрессию в присутствии стеринов и стероидов прегнанового ряда. Результаты важны для понимания особенностей функционирования путей катаболизма стероидов у актинобактерий и определения мишеней для генетической инженерии при создании биокатализаторов с улучшенными биокаталитическими возможностями.Изучены особенности биоконверсии андростадиендиона растущим и отмытым мицелием Drechslera sp. MTOC F-34, выращенным в различных условиях индукции. Экспериментально подтвержден индуцибельный характер 7-гидроксилазной и конститутивный характер 17β-гидроксистероиддегидрогеназной активности мицелия. Определены условия, способствующие максимальному образованию стероидных 17β-спиртов и 7-гидроксиандростанов.Рекомбинантные штаммы Mycolicibacterium smegmatis mc2155 с делеционными мутациями в генах ферментов окисления стероидного ядра: kstD, kshA, kshB были использованы в качестве платформы для гетерологической экспрессии генов стероидогенеза. В клетки M. smegmatis ΔkshB и M. smegmatis ΔkshBΔkshD были перенесены генетические конструкции pNS25, позволяющие ко-экспрессировать гены, кодирующие 17β-гидроксистероиддегидрогеназу гриба Cochliobolus lunatus и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу Mycobacterium tuberculosis H37Rv в составе одного оперона. Полученные рекомбинантные штаммы эффективно продуцировали тестостерон из фитостеринов. Результаты исследований свидетельствуют об эффективности использования делеционных мутантов M. smegmatis в качестве платформы для гетерологической экспрессии генов стероидогенеза и могут быть использованы при создании одностадийных микробиологических способов получения ценных стероидных соединений из фитостеринов.