Физико-химические основы молекулярной биоинженерии

В 2020 году проведены дальнейшие физико-химические и биологические исследования биомолекул, полимеров, нанобъектов, тканей, представляющих интерес для медицины и биотехнологии и определены дальнейшие научные и практические задачи. В отчётном периоде исследовали механизмы накопления и долгосрочного хранения в клетке азота (N) - важнейшего макроэлемента для минерального питания микроводорослей, влияющий на их продуктивность, состав и динамику роста. Накопление экзогенного N в виде кристаллического гуанина оказалось широко распространенным среди неродственных групп микроводорослей из различных местообитаний, от пресноводных и морских свободноживущих форм до эндосимбиотических микроводорослей кораллов-рифостроителей (Acroporamillepora , Euphylliaparaancora). С использованием методов NGS провели исследования микробных сообществ, ассоциированных с различными организмами, в результате получены новые данные о микробиомах кишечников животных, в том числе пяти видов беломорских рыб, выловленных в Кандалакшском заливе Белого моря - Gadusmorhuamarisalbi, Clupeapallasii, Myoxocephalusscorpius, Cyclopteruslumpus, Liopsettaglaciali - методом метабаркодинга по 16S рРНК. Определены возможны пути оптимизации эффективности аквакультур за счет манипулирования микробным сообществом кишечника рыб. Методами суперкомпьютерного моделирования проведено изучение молекулярной динамики нуклеосом (на масштабе 15 микросекунд) и динуклеосом. Изучены процессы отворачивания и дыхания ДНК в нуклеосомах. Методами молекулярного моделирования проведен дизайн конструкций биосенсоров нуклеиновых кислот на основе dCas9 белков. Проведена разработка алгоритмов моделирования нуклеосомных фибрилл на основе данных экспериментов Micro-C. Проведено обновление базы данных гистоновых вариантов HistoneDB http://histdb.intbio.org, добавлен раздел, посвященный гистонам человека. Cоздана база данных структур нуклеосом http://nucldb.intbio.org. Была решена задача об определении уровня экспрессии генов в процессе эпигенеза в опухолевых и здоровых тканях в зависимости от значения величины метилирования цитозина в «CpG-островках» нуклеотидной последовательности ДНК генома человека. C помощью метода криоэлектронной микроскопии нами была получена структура асимметричного комплекса GroES-GroES c разрешением 3.8 А. НА основе ЭМ получены трехмерные структуры закрытого и открытого FACT и открытого FACT с нуклеосомой в развернутом состоянии. Исследован процесс созревания псевдоядра у инфицированных фагом phiKZ бактерий P. aeruginosa. Очищены белки канала Кv10.2, получены криоэлектронные изображения канала Кv10.2 в закрытой конформации. Впервые были получены записи тока одиночного канала Kv7.1. Показано, что после очистки белок сохраняет свою физиологическую активность. Исследована электрофизиологическая активность данных мутантных белков. Для модельных липодисков с применением электронной микроскопии была проанализирована зависимость размера липодисков от липидного состава мембраны. Изучена морфология инактивированных вирусов SARS-Cov-2 Разработана система продукции рекомбинантного трехпетельного белка PSCA, экспрессия которого существенно повышена в коре головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера. Исследовано влияние различных факторов на процесс амилоидогенеза искусственного белка альбебетина. Исследованы факторы, оказывающие влияние на уровень биосинтеза терапевтических рекомбинантных антител класса IgA в клетках млекопитающих. Показано, что сконструированный нами рецептор-специфичный вариант DR5-B цитокина TRAIL обладает повышенной противоопухолевой активностью, в том числе при комбинированном действии с химиопрепаратами; он ингибирует рост опухоли в ксенотрансплантантах, обладает увеличенным периодом полувыведения по сравнению с TRAIL дикого типа и, таким образом, может стать эффективным противоопухолевым средством. Разработаны химерные лиганды калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1, объединяющие в своем составе высокоаффинный пептидный блокатор каналов Kv1 хонготоксин 1 (HgTx1) и красный флуоресцентный белок tagRFP, локализованный на N- или С-конце HgTx1 (RFP -HgTx1 и HgTx1-RFP). Эти лиганды могут быть использованы в составе разработанных нами ранее тест-систем на основе гибридных каналов KcsA-Kv1.x (x = 1, 3) для поиска и изучения блокаторов калиевых каналов, как перспективных средств коррекции активности Kv1-каналов при лечении некоторых заболеваний Проведено комплексное исследование изменения физико-химических свойств полиоксиалканоатов (ПОА) при их биодеградации в модельных условиях in vitro, а также их влияние на рост и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток. Разработана методика выращивания клеток рака головы и шеи в объеме с использованием в качестве субстрата пористых микросфер на основе поли-3-оксибутирата. Исследован состав микробиоты в области повреждения слизистой кишечника на модели повреждения стенки кишечника и ее регенерации с использованием композитной конструкции на основе поли-3-оксибутирата и бактериального альгината. Развитие методик исследования внеклеточных везикул, в частности, экзосом, секретируемые опухолевыми клетками, методами микроскопии высокого разрешения. Для обработки изображений везикул, полученных методом ПЭМ, разработана программа на основе сверточной нейросети с веб-интерфейсом. Продолжены работы по исследованию липодисков методом атомно-силовой микроскопии. Исследование рельефа субстрата на форму здоровых и опухолевых клеток, показало, что ядра опухолевых клеток более чувствительны к рельефу субстрата – они сильнее деформируются и ориентируются при культивировании клеток на субстрате с периодически расположенными бороздками и выступами. Исследовали молекулярные основы функционирования про-опухолевого фактора FACT и онкосупрессора p53 при эпигенетической регуляции генов в хроматине на уровне нуклеосом, а также проводили изучение механизмов модуляции активности этих белковых комплексов различными факторами (ковалентные модификации и вариантов гистонов H2A.Z, ацетилированного гистона H3). Проводили исследование нуклеосом-связывающих пептидов (фрагментов вирусов) на реорганизацию нуклеосом. Охарактеризованы особенности взаимодействия мутантных форм PARP-1 с нуклеосомами и получены данные, проясняющие структурно-функциональную роль отдельных доменов PARP-1 в ремоделировании хроматина. С использованием мутантных и нативной форм PARP-1 получены данные о взаимодействиях ингибиторов PARP-1 олапариба и госсипола с комплексами нуклеосома-PARP-1; об их воздействии на структуру нуклеосом в присутствии и отсутствии фермента; об их влиянии на НАД+- индуцированное автоПАРилирование и структурные изменения в нуклеосомах. Исследованы механические свойства, вторичная структура, остеогенный и нейрогенный потенциал полученного ранее метакрилированного производного фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyxmori (FbMA). Было показано, что дифференцировка нейрональных клеток линии SH-SY5Y на FbMA увеличивала длину нейритов, а также уровни маркеров нейральной дифференцировки MAP2 и βIII-тубулина. Также были проведены исследования биологической активности рекомбинантного аналога спидроина 1 Nephilaclavipes (rS1/9). Было показано, что субстраты на основе rS1/9 оказывают протекторное действие на фибробласты кожи мыши NIH 3T3 при добавлении высоких концентраций глюкозы, способствуя снижению апоптоза и увеличению пролиферации клеток, а также предотвращению появления других маркеров клеточного старения. Разрабатываемые междисциплинарные исследовательские подходы могут быть вдальнейшем использованы для исследования различных сложных процессов, включающих множественные факторы и сложную динамику, поэтому будут интересны широкому кругу учёных. При реализации работ были использованы современные высокотехнологичные методы исследований средствами атомно-силовой, конфокальной, электронной микроскопии, компьютерного моделирования с использованием мощностей суперкомпьютеров. Результаты выполненных исследований и сопоставление результатов с мировым уровнем позволяют утверждать, что полученные данные соответствуют тенденциям и уровню выполняемых в мире аналогичных исследований в этой области и имеют перспективы для дальнейшего развития, в том числе и с целью практического использования в клинической практике. Ряд исследований был интегрирован в образовательный процесс в качестве тем для выполнения бакалаврских и магистерских работ, а также задач большого практикума для студентов кафедры биоинженерии. Показателями успешности и признания исследований, проводимых сотрудниками кафедры биоинженерии являются наличие многочисленных проектов, финансируемых различными фондами: РНФ. РФФИ, Минобрнауки и пр, наличие большого списка публикаций, участие в международных и отечественных конференциях , защищенные на кафедре диссертации и полученные патенты.