Генетика, геномика и генная инженерия бактерий.

Продолжено исследование генетического контроля функционирования фотосистем I и II у одноклеточной цианобактерии Synechocystis 6803 c использованием полученных ранее мутантов, лишенных отдельных компонентов фотосинтетического аппарата. Исследована кинетика флуоресценции клеток дикого типа Synechocystis PCC 6803 и мутантов c различным редокс-состоянием пластохинонового пула (PQ). Продемонстрировано высокое содержание фотохимически неактивных реакционных центров ФСII в клетках мутанта Ox. Сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC6803, лишенные одной из дыхательных дегидрогеназ (Cox или Cyd), а также флавопротеинов Flv1/Flv3, участвующих в переносе электронов на кислород на акцепторной стороне фотосистемы I. Для выяснения роли апопротеина АрсЕ в механизме ОСР-зависимого нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC 6803 с делецией полной последовательности гена арсЕ, а также последовательностей гена арсЕ, кодирующих петлю в хромофорном домене и один из линкерных доменов. Впервые показано, что у мутанта с полной делецией гена арсЕ отсутствует, а у мутантов с делецией петли и с делецией третьего линкерного домена заметно снижено ОСР-зависимое нефотохимическое тушение флуоресценции фикобилисом. Полученные данные свидетельствуют о том, что сайтом ОСР-зависимого нефотохимического тушения флуоресценции фикобилисом может служить белок АрсЕ. Сконструирован мутант Synechocystis sp. PCC 6803, лишенный хромофор-связывающего PBLсм домена ApcE. Мутация приводит к нарушению передачи энергии к терминальным эмиттерам внутри PBS, потере способности PBS прикрепляться к тилакоидной мембране, нарушению процесса передачи энергии от PBS к фотосистеме II и отсутствию OCP-зависимого тушения флуоресценции фикобилисом. Для изучения влияния альтернативных путей транспорта электронов на фотосинтез сконструирован мутант Synechocystis sp. PCC 6803, лишенный флавопротеинов Flv1/Flv3. Механизм регуляции переходных состояний фотосинтетического аппарата цианобактерий исследован с помощью мутанта лишенного сукцинатдегидрогеназы, а также мутанта, лишенного цитохром- и хинолоксидаз, которые различались по редокс-состоянию пула пластохинона в темноте. Выделены бактериологически чистые культуры цианобактерий, обитающих в различных почвенных, водных и растительных биоценозах в ряде климатических зон, включая экстремальные условия Антарктики. Разработаны молекулярно-генетические методы оценки генетического разнообразия доминирующих и минорных цианобактериальных компонентов, как свободноживущих, так и встречающихся в ассоциациях с водными растениями или мохообразными. Расширена имеющаяся на кафедре генетики МГУ коллекция природных цианобактериальных штаммов. Осуществлена морфологическая и физиолого-биохимическая характеристика ряда ранее неизученных штаммов Anabaena. Проведен молекулярно-генетический анализ этих штаммов. Получены штаммы с повышенной эффективностью выделения молекулярного водорода, перспективные в фотобиотехнологии. Проведено полногеномное секвенирование двух новых близкородственных симбиотических изолятов модельного штамма филаментозной цианобактерии Trichormus variabilis (Anabaena variabilis ATCC29413).Показано, что ряд изолятов Anabaena (как эпифитных, так и симбиотических) выделенных в различных регионах (США, Вьетнам, Австралия), по некоторым молекулярно-генетическим характеристикам практически неотличимы от модельного штамма Anabaena variabilis ATCC29413. Результаты анализа геномов исследованных штаммов указывают на высокую стабильность генома A.variabilis. На основе штамма Trichormus variabilis (Anabaena variabilis ATCC29413) с использованием разработанной нами оригинальной методики получено и охарактеризовано несколько типов терморезистентных мутантов. С использованием методов генетической инженерии проведено конструирование мутантных штаммов по ряду генов, включенных в процессы образования и выделения молекулярного водорода в клетках Trichormus variabilis. Проведен поиск среди низкомолекулярных хелаторов окисного железа сидерофоров, тех, которые способны служить единственным источником окисного железа Впервые показано, что цианобактерия Synechocystis 6803 может использовать в качестве единственного органического источника железа экзогенные дигидроксаматные сидерофоры, такие как шизокинин и сидерофор нитчатой цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413, а также карбоксилатный сидерофор ризоферрин. С помощью направленного инсерционного мутагенеза и функционального анализа исследовано кластер из 14 генов, предположительно кодирующих компоненты систем транспорта сидерофоров. Показано, что все 14 генов исследованного кластера не вовлечены в контроль транспорта неорганического окисного железа в клетки Synechocystis 6803. Показано, что чужеродные дигидроксаматные сидерофоры шизокинин и сидерофор нитчатой цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413 являются высокодоступными и у Synechocystis 6803 поглощаются при помощи TonB-ExbBD-зависимого транспорта. Проведено изучение механизмов и генетического контроля систем транспорта органического железа у одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. Идентифицированы все гены полного пути транспорта сидерофоров из окружающей среды в цитоплазму клетки. С целью изучения возможности экспрессии генов пурпурных бактерий в клетках цианобактерий сконструированы мутанты Synechocystis sp. PCC 6803, несущие гены антенных белков Puc и Puf, входящих в состав реакционного центра Rhodobacter sphaeroides. Начата работа по изучению генетического контроля и молекулярных механизмов накопления и метаболизма полифосфатов в клетках цианобактерий.