Ex vivo тесты для персонализированного подбора противоопухолевой терапии: поиск информативных маркеров гибели клеток

Цель работы. Целью настоящего исследования является разработка принципиально нового подхода к персонализированному подбору противоопухолевой терапии, который основан на исследовании различных вариантов гибели трансформированных клеток и поиске новых маркеров лекарственной чувствительности новообразований с использованием ex vivo анализа первичного опухолевого материала - тканевых пластинок. Объект исследований. Объектом исследований являются коллекции клеточных линий нескольких социально значимых разновидностей новообразований (карциномы молочной железы, яичников, лёгкого). Клетки каждой из перечисленных разновидностей опухолей будут подвергаться воздействию спектра лекарственных препаратов. Кроме того будет использована сформированная коллекция «тканевых пластинок», полученных из опухолей молочной железы, яичника и лёгкого. Степень внедрения. Проект находится на стадии разработки нового подхода к персонализированному подбору противоопухолевой терапии. Полученные в результате настоящего исследования результаты будут применены в научно-исследовательской деятельности, а также рекомендованы для предсказания ответа пациентов, которые направляются на неоадъювантную терапию, и установить, насколько предсказанная нами лекарственная чувствительность опухоли соответствует фактическому исходу неоадъювантной терапии. Помимо этого, результаты исследования могут быть использованы для включения в курсы лекций для студентов и аспирантов медицинских и биологических вузов, а также для курсов повышения квалификации врачей. Полученные результаты на 2м этапе. На втором этапе проекта были исследованы типы программируемой клеточной гибели клеток линий опухолей легкого, рака яичника и рака молочной железы. Было показано, что доксорубицин и топотекан вызывают апоптоз в клетках карциномы яичника CAOV4, доцетаксел – в клетках SKOV3, гецитабин – в клетках U1810. Однако полная блокировка цитотоксического эффекта ингибитором апоптоза достигается только для клеток CAOV4 при их обработке топотеканом. Во всех остальных случаях, восстановление жизнеспособности происходило не полностью. Ферроптоз не вносил какого-либо заметного вклада в действие любого из исследуемых противоопухолевых препаратов. Ингибирование аутофагии само по себе в линиях лёгкого и яичника приводило к угнетению жизнедеятельности клеток, и в случаях обработки доксорубицином, 5-фторурацилом и топотеканом клеток карциномы яичника и гемцитабином для клеток карциномы легкого приводило к усилению действия цитотоксических препаратов. Анализ механизма действия противоопухолевых препаратов показал, что доксорубицин способен стимулировать митотическую катастрофу в клетках карциномы яичника легкого. Анализ биохимических маркеров различных типов гибели и сигнальных каскадов показал, что после формирования состояния митотической катастрофы клетки карциномы яичника и легкого погибали по апоптотическому или некроптотическому пути. Однако, при этом происходило стимулирование аутофагии. Блокировка аутофагии химическим ингибитором вела к усилению как апоптоза, так и некроптоза. Таким образом, аутофагия в данных условиях играла роль механизма ускользания от гибели. Проведено исследование цитостатической активности выборочных химиопрепаратов на различных вариантах культивируемых in vitro клеточных линий рака молочной железы (РМЖ). В стандартных фармакологических тестах получены значения концентрации химиопрепаратов необходимой для полумаксимального ингибирования роста клеток гормононезависимого и гормонозависимого рака молочной железы. Выполнена расширенная идентификация клеточных линий рака молочной железы (РМЖ), различающихся по чувствительности к отдельным противоопухолевым препаратам. Чувствительность выбранных клеточных линий РМЖ в препаратам варьировалась в достаточно широких пределах. Препараты гормонотерапии демонстрируют более высокую активность на клетках линии MCF7, клетки T47D менее чувствительны к таким воздействиям. Цисплатин эффективно подавлял рост HER2-позитивного рака линии SKBR3, остальные выбранные линии были менее чувствительны к этому химиопрепарату. Рост трижды негативного рака MDA-MB-231 в наименьшей степени подавлялся цисплатином. Значения IC50 цисплатина для всех клеточных линий находятся в микромолярном диапазоне концентраций. Антиметаболит 5-фторурацил не был активен в отношении гормононезависимых клеток SKBR3, MDA-MB-231 и HCC1937: для них IC50 превышали уровень 25 мкМ. Проведено исследование маркеров клеточной гибели и уровня активации некоторых сигнальных каскадов до и после воздействия препаратов на клеточных линиях с различным уровнем резистентности, идентифицированных на предыдущих этапах работы, а также на полученных нами ранее клеточных линиях РМЖ с приобретенной резистентностью. Выявлены значительные изменения сигнальных каскадов, возникающие после воздействия выборочных препаратов. Уровень фосфо-AKT, ключевой киназы PI3K пути, возрастал в клетках РМЖ после длительного и краткосрочного воздействия тамоксифена. Активация сигнальных каскадов PI3K/AKT, перестройка профиля микроРНК (в частности, микроРНК-181a-2) и частичное подавление гормональных путей являются важными характеристиками клеточного ответа на длительное воздействие тамоксифена. Выявлено, что при формировании устойчивости к тамоксифену не возникает перекрестной устойчивости РМЖ к другим выборочным препаратам (доцетакселу, 5-фторурацилу, доксорубицину и цисплатину). Гиперактивация S6K выявлена после длительной инкубации клеток MCF7 с фулвестрантом, но не с тамоксифеном. Длительное воздействие активного метаболита тамоксифена вызывало в клетках увеличение экспрессии CD-274. Ответ клеток на антиметаболит 5-фторурацил включал рост уровня фосфо-AKT и фосфо-ERK ½. Анализ сигнальных каскадов PI3K/AKT и mTORC1/S6K в комплексе с профилированием микроРНК (miR-181a-2 и других) можно рассматривать в качестве возможного ex vivo теста для оценки ответа клеток на выборочные препараты. Завершен сбор коллекции тканевых пластинок. За отчетный период в коллекцию тканевых эксплантов были включены образцы 68 пациентов с немелкоклеточным раком легкого, 11 пациентов с раком молочной железы, 3 пациента с раком яичника. Тканевые экспланты инкубировали с различными препаратами и фиксировали для дальнейшей экстракции РНК. Выполнена серия экспериментов по инкубации клеточных культур с выбранными химиопрепаратами. Клетки после обработки были подвергнуты транскриптомному анализу. Были определены маркеры дифференциально экспрессирующиеся после воздействия препаратов. В целом основным эффектом всех препаратов на профили экспрессии генов стало увеличение экспрессии маркеров остановки пролиферации, что согласуется с результатами определения типов программируемой клеточной гибели. Транскриптомный анализ тканевых пластинок заведомо чувствительных к гефитинибу (содержащих мутации в гене EGFR) позволил дополнить перечень маркеров для дальнейшего анализа клинической эффективности.