Физиология и биохимия фототрофных и хемотрофных микроорганизмов

Проведена работа по поиску новых родопсиновых белков. Для наибольшей представленности генов ACR при анализе мы использовали ген-специфические ПЦР-праймеры в сочетании с вырожденными, в том числе и для одних и тех же участков генов (например, праймеры RhACR12,13,14). Из-за кодон-оптимизации генов ACR, представленных в базе данных GenBank:, идентификацию ПЦР-продуктов проводили в режиме BLASTx для поиска охарактеризованных белков ACR. Путем перебора праймеров на геномной ДНК черноморского изолята Rhodomonas sp. был получен ACR-специфический ПЦР-фрагмент, CryACR (праймеры 11+12 или 11+14), кодирующий продукт, гомологичный R1ACR_447 из Rhodomonas sp. CCMP768 (95% идентичности;). При анализе тотальной ДНК из природного беломорского образца, содержащего эндемичный Rhodomonas sp., для выявления генов ACR одного раунда ПЦР оказалось недостаточно: ACR-специфический ПЦР-продукт (праймеры 11+13) был получен только после предварительной амплификации геномной ДНК с праймерами 4+6. Фрагмент гена RhoACR кодирует продукт, отдаленно гомологичный R2ACR_853 из Rhodomonas sp. CCAC1630 (56% идентичности; Табл. 4). При этом оба идентифицированных гена, CryACR и RhoACR, в разной степени гомологичны нативному транскрипту RhACR_1591 из Rhodomonas sp. CCMP768, что также указывает на отдаленное родство RhoACR с известными генами ACR и на его возможную функциональную уникальность. Были продолжены работы по изучению ферментов антиоксидантной защиты у аноксигенных фототрофных бактерий. Получены данные по регуляции синтеза ключевых ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы) у пурпурных несерных бактерий Rhodospirillum rubrum и Rhodoseudomonas palustris при различных условиях культивирования (в анаэробных условиях на свету при росте на водороде и в аэробных условиях в темноте при росте на малате), а также в условиях пероксидных стрессов. Проведён углублённый биоинформационный анализ наличия генов, кодирующих ферменты антиоксидантной защиты, во всех анонсированных к настоящему времени полных геномах аноксигенных фототрофных бактерий: обнаружено, что большинство из них содержат гены, кодирующие СОД и цитохром с пероксидазу. Новизна данной работы заключается в исследовании закономерностей функционирования антиоксидантных систем в зависимости от физиолого-биохимических особенностей аноксигенных фототрофов и их таксономического положения, поскольку к настоящему времени ферменты антиоксидантной защиты у них практически не изучены. Выполнена работа по теме « Бактериальная биолюминесценция - факторы стабилизации и инактивации свечения бактерий». Получены новые данные по температурной инактивации и реактивации свечения бактерий. Установлены критические значения температу , вызывающих обратимую и необратимую потерю свечения. никотемпературных штаммов из Белого моря. Предложены методы реактивации свечения бактерий. Продолжены работы по изучению антиоксидантных свойств молочнокислых бактерий (МКБ) родов Lacticaseibacillus и Lactobacillus. На Lcb. reuteri, Lb. rhamnosus и Lb. plantarum завершены микробиологические эксперименты по определению уровней устойчивости соответствующих культур к кислородным и пероксидным окислительным стрессам в зависимости от концентрации окислителей в жидкой питательной среде MRS и времени экспозиции. Показано, что наиболее аэротолерантным штаммом является Lb. rhamnosus КМ МГУ 529, способный к росту в условиях сильной аэрации в присутствии гемина (38 мкМ) и менахинона (18 мкМ). Практически все исследованные штаммы МКБ были способны выдерживать концентрации H2O2, равные 1-3 мМ, хотя скорость их роста и выход биомассы снижались на 20-45%; наиболее устойчивым к пероксидным стрессам штаммом оказался Lb. plantarum КМ МГУ 161. Показано резкое, вплоть до 8-12 раз, увеличение активностей ключевых ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы) у Lb. rhamnosus и Lb. plantarum в условиях сильных (3-6 мМ) пероксидных стрессов. Также получены данные по позитивному влиянию различных нитропроизводных (метронидазола, саназола, гистидина в концентрациях 0,5-2,0 мкМ), являющихся антиоксидантами, на устойчивость клеток Lb. reuteri к сильным кислородным и пероксидным стрессам. Сравнивали антимикробную активность в живых культурах (пробиотиках) Lactococcus lactis и Lactobacillus acidophilus и в их лизатах, образующихся в процессе ферментации или в стрессовых условиях ЖКТ (метабиотиков). Бактерицидная активность ряда штаммов была до 40 % выше в лизатах. Установлено специфическое влияние 6-ти аминокислот- предшественников нейромедиаторов, предварительно добавляемых в среду культивирования, на рост, спектр антимикробного действия и синтез нейромедиаторов в плане создания психибиотиков. Была проведена работа по изучению кератинолитических свойств 22 новых штаммов микромицетов, выделенных из образцов почвы, отобранных в курятниках, расположенных в разных географических зонах России. Было показано, что культура Tolypocladium inflatum ST1, ранее не известная как кератинолитик, способна к активной секреции кератиназ при росте на отходах животноводства – куриных перьях и свиной щетине. Были определены последовательности генов, кодирующих образование протеаз у микромицетов Aspergillus alliaceus 7dN1, A. flavus O-1, A. clavatus VKPM F-1593, A. sydowii 21. Было показано, что данные ферменты принадлежат к группе протеиназы-К-подобных субтилизиновых протеаз, определены границы их сигнальных последовательностей, пропептидных и протеазных доменов, а также аминокислоты их каталитических триад. Изучены анаэробные сообщества, ранее адаптированные к разрушению 2-АБК, на проявление активности по отношению к полистиролу (ПС) в разных донорно-акцепторных условиях. Показано, что микробное сообщество в метаногенных условиях с ПС продуцирует в 9 раз больше CH4 и в 2,3 раза – CO2, чем контрольные варианты без пластика. В нитратредуцирующих условиях с пируватом как ко-субстратом разница в продукции CH4 для сообщества с ПС составила до 100 раз, а CO2 - до 8,8 раза. Также в вариантах с ПС был обнаружен N2O в количестве до 0,6 мМ. В сульфатредуцирующих условиях с лактатом натрия и ПС в конце опыта образование CH4 было на 70% выше, чем в контроле. Продукция CO2 в вариантах с ПС превышала данный показатель для контроля на 10%, а H2S - в 2,5-3 раза, чем в вариантах без ПС. Продолжены работы по изучению трансформации тяжелых металлов (на примере хроматов) клетками сульфатредуцирующей бактерии (СРБ) Desulfovibrio deсhloracetivorans штамм Sev11.5, выделенной ранее из черноморских газонасыщенных прибрежных донных отложений в акватории г. Севастополя. Данная СРБ оказалась весьма устойчивой к высоким концентрациям хроматов (1-2 мМ), сохраняя способность к росту в их присутствии. Была показана значительная скорость восстановления хроматов сгущенными суспензиями клеток штамма Sev11,5 в присутствии лактата как донора электронов – 500 мкМ K2CrO4 или (NH4)2CrO4 за 60 мин. Проведен анализ разложения пластиков на основе полипропилена (ПП) и поливинилхлорида (ПВХ) под влиянием анаэробных микробных сообществ. В результате инкубирования микробных сообществ с пластиком масса ПВХ в опытных образцах первого пассажа уменьшилась на 6.5%, а ПП – на 4.4% за два месяца культивирования. В последующих пересевах уменьшение массы пластиков продолжилось, однако, с меньшей эффективностью. Поверхностные изменения ПП, исследованные с помощью измерения угла смачивания, показали, что для исследованных образцов ПП угол смачивания практически не изменялся по сравнению с исходным материалом и составлял порядка 90°, тогда как в присутствии бактерий у ПВХ образца величина Θ уменьшается до 65-70°, что свидетельствует о биогенном воздействии на образец. Полученные результаты подтверждают процесс анаэробной деструкции изделий, в том числе т за счет гидролиза присутствующих в изделиях добавок. Проведен всесторонний статистический анализ результатов профилирования микробных сообществ более 150 образцов воды и грунта Баренцева моря. В результате были выявлены достоверные закономерности распределения микроорганизмов в воде, наилке и грунте, описаны постоянные и вариативные компоненты соответствующих микробных сообществ. Были изучены закономерности распределения отдельных групп микроорганизмов в зависимости от таких характеристик грунта, как литологический состав, Eh, толщина комплекса морских осадков, степень обводненности грунта, наличие гидротроилитовых прослоев, общая численность микроорганизмов в осадке и тд. Был выявлен ряд корреляций между количеством и распределением углеводородов-биомаркеров в битумоиде «А» и численностью отдельных групп микроорганизмов. Совокупность выявленных закономерностей распределения некультивируемых групп микроорганизмов позволила выдвинуть ряд обоснованных гипотез о фенотипе их представителей и об их роли в описываемых микробных сообществах. Исследовано разнообразие и роль микроорганизмов различных физиологических и филогенетических групп в процессе анаэробного окисления метана. Целью данного проекта является изучение биологических механизмов окисления метана в анаэробных микробных сообществах. Научная новизна работы заключается в исследовании значимых, но малоизученных биотопов, в которых развиваются анаэробные метанотрофы (наземные грязевые вулканы ответственны за эмиссию 25-30% геологического метана и являются «окнами в подземную биосферу»), а также в поиске новых подходов к культивированию микроорганизмов, вовлеченных в АОМ (новые или малоисследованные акцепторы электронов, различные температуры). В ходе этого года работы были исследованы микробные сообщества природных образцов: грязевых вулканов Тамани (50 образцов); грязевых вулканов Азербайджана (63 образца); образцов грунтов Узбекистана (35 образцов); донных отложений Карского моря (106 образцов); донных отложений из различных структур разгрузки углеводородных флюидов, области поверхностных нефтепроявлений и газогидратных структур в пределах Центральной и Южной котловин озера Байкал (15 образцов). Для образцов Тамани было также проведено определение общей численности прокариот на основании амплификации гена 16S рРНК методом ПЦР «в реальном времени». Изучено микробное разнообразие донных отложений. Основу микробного разнообразия во всех образцах составляли представители филума Desulfobacterota – культивируемые и некультвируемые сульфатредукторы. В достоверных количествах также обнаружены признаки присутствия метанокисляющих архей ANME. По результатам сборки геномов было продемонстрировано высокое присутствие архей группы ANME-2b в составе сообщества: группа представляет более половины микробов сообщества. Также представлены (29,2%) микроорганизмы филума Desulfobacterota, некультивируемые сулфатредукторы LCP-80. Для этих групп был проведен анализ геномных данных. Проводился поиск генов метаболизма метана и сульфата, в соответствии со схемами, представленными в публикациях. По результатам геномного анализа, у архей ANME-2b был найден основной пул генов, опосредующих сульфат-зависимое анаэробное окисление метана, а также гены причастных электрон-транспортных систем. По итогам геномного анализа можно с высокой степенью достоверности утверждать наличие активного микробного AOM/СР консорциума в изученном районе. Учитывая все вышеизложенные микробиологические, а также геологические особенности, был предложен сценарий/модель образования аутигенных карбонатов в осадках изученного района Восточно-Сибирского моря. С целью изучения распространения и разнообразия гликополимеров клеточных стенок (ГПКС), а также возможности их использования в качестве дополнительных хемотаксономических признаков, изучаются представители большой группы коринеформных бактерий семейства Microbacteriaceae и Micrococcaceae порядка Micrococcales класса Actinobacteria. Продолжены исследования актинобактерий родов Rathayibacter (2 штамма), Clavibacter (5 штаммов), Curtobacterium (3 штамма), некоторые представители которых – патогены растений, экономически значимых для сельского хозяйства, а также Arthrobacter globiformis (1 штамм) и «Paenarthrobacter pyridinovorans» (1 штамм). С помощью методов молекулярно-биологического анализа, а именно NGS секвенирования на базе платформы Illumina MiSeq, было проанализировано бактериальное сообщество корней безлистной орхидеи Мicrocoelia moreauae L. Jonss. Однако было выявлено, что универсальные праймеры и подходы, использующиеся при подобном анализе не позволят выявить полное микробное разнообразие, особенно среди эндофитных бактерий, так как наличие хлоропластной и митохондриальной ДНК преобладает в анализируемых образцах. Поэтому среди доминирующих представителей были отмечены только Pseudomonas и Sphingomonas, а также представители филума Actinomycetota - Actinomycetospora, Curtobacterium и Kineococcus. Среди эндофитов псевдомнады также оказались единственными определёнными этим методом бактериями. Установлено, что большинство изученных штаммов содержат в клеточной стенке несколько гликополимеров различной природы и структуры. Проведены исследования чистые культур микроорганизмов из проб российского сегмента МКС (РС МКС. Изучение морфологических и физиолого-биохимических характеристик выделенных чистых культур дрожжей из РС МКС и больничной лаборатории показало почти полную идентичность их свойств со штаммами для сравнительного анализа – почвенного R.mucilaginosa КБП Y-5300 и типового R.mucilaginosa Y-339 Type.