Эколого-генетические особенности биологической эффективности микробов-антагонистов, энтомопатогенных грибов, нематод и микроспоридий в повышении супрессивности почвы, создании искусственных инфекционных очагов и селекции токсигенных штаммов-продуцентов

В 2022 на основании нового Положения о «Государственной Коллекции энтомопатогенных и фитопатогенных микроорганизмов и их антагонистов», кторой присвоен статус Уникальной Научной Установки (УНУ) 24.01.2013 г., в котором определён её правовой статус, направления деятельности и источники финансирования продолжена работа по созданию единой базы данных коллекции, каталогов культур, а также единой легкодоступной информационной сети. Пополнение коллекции осуществлялось за счет штаммов, выделяемых из окружающей среды (почвы, воды, растений, членистоногих и т.д.), депонирования новых штаммов микроорганизмов. За отчетный период выделены и идентифицированы новые виды и штаммы микроорганизмов, перспективные в качестве продуцентов полифункциональных биопрепаратов, проведена селекция ряда штаммов-продуцентов по целевым признакам, получены новые данные о составе активных комплексов и структуре действующих веществ. Коллекция пополнена 61 новыми перспективными штаммами микроорганизмов. За отчетный период продолжено генотипирование методом ДРИМ коллекционных штаммов бацилл и пектобактерий – возбудителей болезней растений, хранящихся в «Государственной коллекции микроорганизмов, патогенных для растений и их вредителей» Центра коллективного пользования научным оборудованием «Инновационные технологии защиты растений" ФГБНУ ВИЗР». В 2022 г. оценена возможность метода RAPD-PCR для генетической идентификации штаммов фитопатогенов родов Pectobacterium и Xanthomonas. Оптимизирован метод RAPD-PCR для генотипирования штаммов B.subtilis с использованием трех праймеров. Продолжена разработка методов выделения и очистки активных вторичных метаболитов, продуцируемых штаммом B. subtilis М-22 на основе несколько классических методических подходов, применяемых для выделения органических соединений из сложных смесей природного происхождения. Выделена фракция, обладающая фунгицидной активностью и содержащая два основных компонента. Методами масс-спектрометрии высокого разрешения получены масс-спектры этих компонентов, а спектрофотометрии – их ультрафиолетовые спектры. Полученными данными, с высокой долей вероятности, предсказана химическая природа активных компонентов, как высокомолекулярных соединений углеводной природы. Коллекция фитопатогенных бактерий пополнена выделенными из 24 растительных образцов пораженного картофеля с симптомами черной ножки и мягкой гнили 12-ю изолятами (предположительно, рода Pectobacterium), у которых начато изучение биологических особенностей. Проведена оценка патогенных свойств ряда коллекционных штаммов родов Pectobacterium и Dickeya. В 2022 г продолжена работа по восстановлению штаммов, сохраняемых более 60-ти лет в лиофильно высушенном состоянии на обезжиренном молоке в атмосфере аргона в запаянных стеклянных ампулах, более 30 лет - в виде водных суспензий и на стерильном кварцевом песке в запаянных стеклянных ампулах. Результаты проведённых исследований показали, что клетки культур Streptomyces levoris 007 ВИЗР, Streptoverticilium hachijoensis 022 ВИЗР, Streptomyces viridochromogenes 0038 ВИЗР, Streptomyces sp. 0037 ВИЗР сохранили аутентичность и высокую жизнеспособность после 63-х лет хранения. Культуры сохранили первоначальные морфологические признаки, физиологические характеристики, биохимическую активность и стабильность. Оценка их антагонистических и инсектицидных свойств на экономически важных тест-объектах показала, что они перспективны для разработки на их основе новых микробиологических препаратов для защиты сельскохозяйственных растений от опасных заболеваний и вредных членистоногих. Проведено генотипирование 45 изолятов грибов р. Beauveria, выделенных из различных видов саранчовых, собранных на территории Северокавказского и Южного ФО (Республика Дагестан и Калмыкия, Краснодарский и Ставропольский край, Астраханская, Волгоградская и Ростовская область, 2020-21 г.г.) по участку гена tef1α и локусу B (Bloc). Обнаружено только два вида – B. bassiana и B. pseudobassiana, при этом последний вид был представлен только одним изолятом (2.2% от всей выборки, рис. 1). В пределах B. bassiana было обнаружено две крупные клады. Наиболее многочисленной из них (60% изолятов) оказалась клада, близкая к референсному штамму ARSEF 2040. Вторая (27 % изолятов) – соответствовала ARSEF 1811. Минорное количество изолятов (3 изолята) были отнесены к кладе, близкой штамму ARSEF 1564. Проведена молекулярная идентификация видов 16 новых природных изолятов Lecanicillium-подобных грибов. В качестве дополнительного локуса для уточнения идентификации использован локус ITS с праймерами, разработанными для рода Lecanicillium. По результатам секвенирования последовательностей трех генных локусов (NAD1, TEF и ITS) проведен филогенетический анализ. До вида идентифицировано 15 изолятов. Выявлено преобладание вида Akanthomyces muscarius (= Lecanicillium muscarium), один изолят (Ak 6) не проявил достаточного сходства с референтными сивенсами и возможно относится к новому таксону. Большинство изученных изолятов вида A. muscarius обладали высокой вирулентностью. Изоляты вида A. lecanii и рода Simplicillium не вызывали заражения персиковой тли и ее гибели. У 10 изученных изолятов была обнаружена способность подавлять рост различных фитопатогенных грибов. Выявлена фунгистатическая активность летучих органических соединений (ЛОС) изолятов Lecanicillium-подобных грибов. Начата работа по подбору питательных сред и условий культивирования перспективных штаммов. Оценена биологическая эффективность лабораторного образца биопрепарата в форме смачивающегося порошка против самшитовой огневки на самшите в Перкальском дендрологическом парке (г. Пятигорск). Лабораторный образец биопрепарата на основе бластоспор энтомопатогенного гриба L. muscarium штамм Г-033 ВИЗР (препаративная форма – смачивающийся порошок) показал среднюю эффективность против гусениц самшитовой огневки Cydalima perspectalis (старшие возраста). Получены экспериментальные материалы для разработки ТУ и технологических регламентов производства биопрепаратов на основе грибов р. Beauveria. Показано, что состав среды не оказывает существенного влияния на вирулентность отобранного штамма. Концентрация сахара в диапазоне от 1 до 3% не оказывает существенного влияния на выход бластоспор. Присутствия в ИПС нитрата натрия существенно повышает продуктивность гриба. Оптимальной концентрацией дрожжевого экстракта для получения бластоспор является 0,5%. Продуктивность штамма при добавлении в ИПС дрожжевого экстракта существенно выше в сравнении с белконом. Включение яичного порошка в среду с дрожжевым экстрактом (0,5%) нецелесообразно. Наличие комплекса солей не оказывало существенного влияния на продуктивность штамма. Кукурузный экстракт может являться адекватной заменой экстракту дрожжевому. Концентрация первичного инокулюма оказывает существенное влияние на выход бластоспор. При поверхностном культивировании 5 штаммов наибольшую продуктивность показал штамм ББК-1 при ферментации на рисе и пшене. В лабораторных и производственных исследованиях получены данные, свидетельствующие о возможности эффективного использования: симбиотических бактерий и продуктов их метаболизма в биологической защите картофеля от возбудителей различных заболеваний (парши, фитофтороза и ризоктониоза). С помощью оригинальной методики лабораторного тестирования патогенности отдельных видов энтомопатогенных нематод в отношении комаров - сциарид была показана перспективность их использования в качестве биологических агентов против грибных комариков. На основании изучения инвазионной активности вида Steinernema feltiae (Filipjev) штамм SRP18-91 были определены эффективные нормы, сроки и способы применения нематод в производственных условиях. Продолжены исследования, направленные на оптимизаци препаративных форм на основе микробов-антагонистов и хитозановых композиций. В отчетном году использование полифункционального комплекса «Витаплан, КЖ + 0,1% салицилат хитозана (глубинное культивирование)» определяло статистически достоверное снижение наибольшего количества фитопатологических показателей (развитие корневой гнили, развитие мучнистой росы, число пятен с налетом мучнистой росы, развитие бурой ржавчины, число пустул бурой ржавчины, площадь пустулы бурой ржавчины Использование полифункционального комплекса «Витаплан, КЖ + 0,1% салицилат хитозана (глубинное культивирование)» и «Витаплана, КЖ + 0,1% салицилата хитозана (композиция)» приводило к существенному росту потенциальной урожайности пшеницы на 47,0% и 38,5%, соответственно. Данная тенденция, в основном, связана с выраженным влиянием полифункциональных комплексов на снижение поражаемости растений болезнями, а также с ростом полевой всхожести семян на 29,9% (32,4%), числа зародышевых корней на 25,7% (30,3%), продуктивной кустистости на 20,1% (23,1%), длины колоса на 7,7% (4,2%), массы 1000 зерен на 47,0% (38,5%), числа зерен в колоске колоса на 6,7% (10,6%), а также снижением числа колосков в колосе на 11,4% (10%), соответственно. Научно-производственная апробация в условиях двух технологий возделывания органического картофеля сорта Удача в течение вегетационного сезона 2022 г. в Ленинградской области с использованием опытных образцов полифункциональных биопрепаратов на основе B. subtilis И5-12/23 (жидких (суспензионных концентратов) – Картофин, СК и мультиконверсионных – Картофин МК, СК; мультиконверсионных субстрат-ассоциированных (гранулированных) – Картофин ШВ, Г) и T. asperellum T-36 (мультиконверсионных субстрат-ассоциированных (гранулированных) – Фитолар ШВ, Г и жидких (суспензионных концентратов) – Фитолар МК, СК) показала их высокую эффективность в защите культуры картофеля сорта Удача от болезней при органическом возделывании и предотвращении распространения и развития вредоносных заболеваний картофеля в хранении. Для различных погодно-климатических условий Ленинградской области и хорошо окультуренной почвы разработаны технологические регламенты применения опытных образцов полифункциональных биопрепаратов на основе B. subtilis И5-12/23 и T. asperellum T-36 в высокоэффективной защите органического картофеля. Применение лабораторных образцов полифункциональных биопрепаратов на основе B. subtilis И5-12/23 и T. asperellum T-36 в соответствии с разработанными технологическими регламентами позволяет эффективно сократить потери от болезней на 50–95 % вегетирующих растений картофеля и на 25–70 % урожая клубней и до 1.5 раз увеличить урожай клубней и их качество, то есть получить прибавку урожая товарной продукции до 10 т/га (в 4 т/га, в среднем). Оптимизация регламентов применения опытных образцов полифункциональных биопрепаратов на основе B. subtilis И5-12/23 и T. asperellum T-36 под различные погодно-климатические условия осуществляется изменением норм расхода биопрепаратов пропорционально лимитирующим факторам.