Исследование способов улучшения пьезоэлектрических свойств биоматериалов на основе полиоксиалканоатов для контролируемого воздействия на живые клетки и ткани

На втором этапе проекта были выполнены исследования и получены результаты по получению пленок и скэффолдов на основе композитов ПОБ с магнетитами, исследованию цитотоксичности полученных скэффолдов на различных культурах клеток in vitro и их биосовместимости при имплантации крысам in vivo, а также изменению физико-химических свойств пленок и скэффолдов в процессе их биодеградации в модельных условиях. С помощью пьезосиловой микроскопии был исследован пьезоэлектрический отклик пленок из поли-3-оксибутирата и его сополимеров. Впервые было показано, что пьезоэлектрический эффект наблюдается только в пленках из гомополимера ПОБ, а в пленках из сополимеров ПОБВ он отсутствует, а также показано, что пьезоэлектрический эффект повышается при увеличении молекулярной массы гомополимера ПОБ. С помощью метода электроформования были также получены скэффолды из композитов ПОБ с магнетитами, обладающие усиленным пьезоэлектрическим эффектом. На мезенхимальных стволовых клетках (МСК) исследована цитотоксичность наночастиц магнетитов с различными характеристиками: разного среднего диаметра (большого - М3, малого – М1, М7), с покрытием лимонной кислотой (М8, М1) и без покрытия (М3, М7, М11), депонированных rGO (М8, М11) и без него (М1, М3, М7). Был исследован рост МСК на композитных пленках из ПОБ, содержащих различную массовую долю магнетитов различных типов (М1, М3, М7, М8, М11). На основании этих экспериментов были отобраны магнетиты М1 (Fe3O4, с покрытием МН лимонной кислотой) и М8 (rGO-Fe3O4, с покрытием МН лимонной кислотой). Помимо МСК был исследован рост клеток различных других типов: фибробластов мыши 3Т3-L1, клеток опухоли гортани человека Hep-2, нейробластомы человека SH-SY5Y, первичных нейронов крысы на полученных скэффолдах и показана их биосовместимость in vitro. Была исследована тканевая реакция при подкожной имплантации скэффолдов из композитов ПОА с магнетитами на лабораторных крысах in vivo при использовании гистологических методов. Было показано, что наблюдается мягкая тканевая реакция на имплантацию скэффолдов следующих типов: ПОБ, ПОБ/М1, ПОБ/М3 и ПОБ/М7. Была разработана система экспериментального моделирования биодеградации, включающая различные экспериментальные модели биодеградации: гидролитическая деградация в модельной среде, ферментативная деградация in vitro, биодеградация при имплантации лабораторным крысам in vivo для исследования их пьезоэлектрических свойств. Было показано, что дизайн используемых экспериментальных моделей позволяет провести математическую обработку полученных данных и моделирование кинетики падения молекулярной массы полимеров, из которых были изготовлены пленки, что является основным показателем биодеградации полимеров. Такая математическая обработка в сочетании с анализом других физико-химических свойств образцов полимерных пленок (прежде всего, физико-термических характеристик (температура плавления, степень кристалличности) и механических свойств (модуль Юнга)) позволяет выявить закономерности процесса деградации полимерных материалов in vitro в модельных условиях. А использование в разработанной системе моделей исследования биодеградации при подкожной имплантации полимерных пленок крысам in vivo позволяет сравнить результаты экспериментального моделирования биодеградации in vitro с данными по биодеградации in vivo, что позволяет выявить основные механизмы биодеградации полимерных образцов. Разработанная система экспериментального моделирования биодеградации была использована для исследования морфологии и физико-механических свойств пленок из ПОА, композитных пленок из ПОБ с магнетитами и скэффолдов из ПОБ с магнетитами процессе их биодеградации. Совместно с научной группой ТПУ был исследован пьезоэлектрический отклик дополнительно полученных партий пленок ПОА. Методом пьезосиловой микроскопии было показано, что пьезоэлектрический эффект наблюдался только в пленках из гомополимера ПОБ, а в пленках из сополимеров ПОБВ он отсутствует. Кроме того, пьезоэлектрический эффект повышается при увеличении молекулярной массы гомополимера ПОБ. На основании полученных результатов был разработан способ биосинтеза ПОБ с сильно различающейся молекулярной массой. Для разработки метода был проведен эксперимент по алгоритму полнофакторного анализа. С помощью разработанного метода синтеза ПОБ были получены полимеры, различающиеся по молекулярной массе в 35 раз, которые можно использовать для дополнительного подтверждения зависимости величины пьезоотклика от ММ ПОБ. Совместно с научной группой ТПУ было исследовано изменение морфологии и физико-механических свойств пленок и скэффолдов, в том числе композитных, в ходе их биодеградации с использованием разработанных моделей биодеградации. Было показано, что ферментативная биодеградация in vitro микроспиннинговых скэффолдов в течение 30 дней не влияет на размеры кристаллитов α-фазы, однако приводит к увеличению вертикального и латерального пьезооткликов чистых ПОБ и гибридных ПОБ/rGO-Fe3O4 микроволокон в 1,3-1,4 раза и в 2-4 раза по сравнению с исходными волокнами, что обусловлено увеличением степени кристалличности вследствие преимущественной биоразложения аморфной фазы. Гибридные ПОБ микроволокна с содержанием rGO 0,7 вес.% обладают самым высоким вертикальным и латеральным пьезооткликом, как до (0,45 ± 0,08 пм/В и 0,56 ± 0,12 пм/В, соответственно), так и после биодеградации (0,59 ± 0,03 пм/В и 1,06 ± 0,02 пм/В, соответственно) среди чистых ПОБ и гибридных ПОБ/rGO-Fe3O4 микроволокон, что вызвано более высоким содержанием пьезоактивной β-фазы, формирование которой происходит из проходных полимерных цепей между ламелями из-за встраивания rGO. Была разработана методика, с использованием которой можно исследовать воздействие механических и электрических стимулов на жизнеспособность и рост пробиотических бактерий Escherichia coli и Lactobacillus fermentum на скэффолдах из композитов ПОБ с магнетитами. Было показано, что бактерии обоих видов адгезируются и растут на контрольных (из ПОБ) и композитных пленках ПОБ/М1, а также на контрольных (из ПОБ) скэффолдах, но не адгезируются к композитным пленкам из ПОБ/М8. Это позволит затем измерить, как воздействие механических и электрических стимулов будет влиять на прикрепление и рост пробиотических бактерий на скэффолдах. Для совместного освоения методик исследования воздействия постоянного и магнитного поля на рост клеток на скэффолдах с улучшенным пьезоэлектрическим эффектом, улучшения взаимодействия научных групп, обсуждения полученных данных, обучения методикам, разработанным и применяемым в МГУ и ТПУ, и использования высокотехнологичного оборудования в обоих университетах, были проведены командировки 2-х сотрудников из МГУ в ТПУ и 1-ого сотрудника ТПУ в МГУ. В ходе командирования совместно с коллегами из ТПУ была проведена работа по получению опытных образцов электроформованных скэффолдов из композита ПОБ с магнетитом и контрольного – из чистого ПОБ с заданными характеристиками. Была проведена разработка метода исследования влияния постоянного магнитного поля разной интенсивности (100, 200 и 300 мТ) на прикрепление и рост клеток (МСК костного мозга крысы и 3Т3-L1 мыши) на скэффолдах из композита ПОБ/М1 и ПОБ на разных сроках их культивирования. Был разработан дизайн эксперимента по исследованию влияния переменного переменного магнитного поля разной частоты (20 Гц, 50 Гц, 100 Гц) и разной интенсивности (50 и 200 мТ) на прикрепление и рост клеток на композитных скэффолдах на разных сроках их культивирования с учетом конструкционной особенности генератора переменного магнитного поля. С помощью биохимического метода анализа жизнеспособности клеток (теста Аламар-блю), флуоресцентной микроскопии и сканирующей электронной микроскопии было показано, что наблюдается прикрепление и рост клеток под воздействием постоянного поля интенсивностью от 100 до 300 мТ и наблюдаются тенденции различия роста клеток при воздействии на них постоянного тока различной интенсивности. Однако, для набора экспериментальных данных достаточного объема и статистического подтверждения этих различий требуется проведение дополнительных исследований. Были написаны и отправлены в журналы Q1 2 совместные статьи. Таким образом, данный Проект является ярко выраженным междисциплинарным исследованием, где решаются как фундаментальные, так и прикладные научные проблемы.