Роль клеточно-матриксных взаимодействий в развитии опухоли и её резистентности при терапевтических воздействиях (промежуточный) (2021)

Проект направлен на получение новых знаний о роли клеточно-матриксных взаимодействий в развитии опухоли и её резистентности к терапевтическим воздействиям путем исследования фенотипических и морфофункциональных особенностей опухолевых клеток при культивировании in vitro в различных моделях опухолевого роста: (i) 2D монослойной культуре клеток при их выращивании на адгезивных покрытиях, (ii) 3D-моделях на основе матриксов контролируемого состава, полученных из природных материалов, таких как коллаген и гиалуроновая кислота, и (iii) 3D-моделях на основе децеллюляризованных органных матриксов животных. Исследования выполняются с использованием линий клеток с гиперэкспрессией клинически значимых онкомаркеров, а именно эпидермоидной карциномы человека A431 (гиперэкспрессия EGFR), карциномы яичника человека SKOV-3 и SKOV-3.ip (гиперэкспрессия HER2), аденокарциномы молочной железы человека SKBR-3 и их флуоресцентных производных. Выбор линий клеток обусловлен поставленной задачей по поиску возможности повышения эффективности таргетной терапии путем модификации взаимодействий типа клетка-матрикс. Нижележащие сигнальные пути рецепторов семейства EGFR (HER), как хорошо доказано, тесно взаимодействуют с сигнальными путями, активируемыми интегринами. В некоторых случаях можно говорить о существовании корецепторного комплекса, включающего интегрины и рецепторы факторов роста данного семейства. Основной методологический акцент в работе сделан на развитии подхода с использованием оптических методов и флуоресцирующих линий клеток, в том числе экспрессирующих генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры. В рамках работ на третьем этапе проекта установлены особенности ответа опухолевых клеток, культивируемых в 3D-модели опухолевого роста в коллагеновом матриксе, на действие сывороточной и глюкозной депривации, а также гипоксии. Нами показано, что устойчивость клеток к дефициту необходимых для роста веществ существенно зависит от генетических и метаболических особенностей клеток и может избирательно проявляться в отношении лишь некоторых из факторов. Так, линия SKOVip-kat продемонстрировала высокую устойчивость к дефициту глюкозы и гипоксии, однако она является крайне чувствительной к присутствию компонентов сыворотки, предположительно ростовых факторов и цитокинов. Напротив, клетки А431-GFP способны переносить практически полное отсутствие сыворотки, однако требуют высоких концентраций глюкозы и кислорода. Контакт с матриксом может количественно модифицировать ответ клеток по сравнению с монослойной культурой, при этом общие закономерности сохраняются. Сравнение ответа клеток, культивируемых в монослое и коллагеновом матриксе, на действие низкомолекулярного агента цисплатина и рекомбинантного таргетного токсина позволило выявить различия в чувствительности клеток к действию данных агентов. Данный блок работ также выполнен с использованием флуоресцентных методов. С помощью генетически кодируемого сенсора активации каспазы 3 была зарегистрирована динамика развития апоптоза при действии цисплатина, показавшая его быструю индукцию в течение первого часа после начала действия соединения. Аналогичный подход, основанный на неинвазивной регистрации сигнала пероксид-чувствительного сенсора HyPer, позволил установить временные параметры окислительного стресса в опухолевых клетках, вызванного фотодинамическим воздействием. Установлено, что в течение 1-2 часов после облучения в клетках, культивируемых в коллагеновом матриксе, наблюдается временное накопление пероксида водорода, предположительно вследствие вторичных темновых процессов, развивающихся вследствие первичного фотохимического воздействия. Второй из развиваемых подходов основан на получении бесклеточных (децеллюляризованных, ДЦЛ) матриксов органов животных и их последующей репопуляции опухолевыми клетками. Нами были исследованы биомеханические свойства полученных ДЦЛ матриксов органов мыши и проанализирована их возможная связь со способностью к репопуляции опухолевыми клетками. Показано, что матриксы с большей жёсткостью или полученные от органов с выраженной каспулой, таких как селезёнка и яичник, обладают меньшей способностью к репопуляции. Напротив, высокая пористость и низкая жёсткость матрикса, например, в случае лёгких, являются факторами, способствующими заселению опухолевыми клетками, что может быть причиной формирования выделенных метастатических ниш. Кроме этого, увеличение размера пор и снижение упругих характеристик матрикса способствует проявлению более мезенхимального фенотипа опухолевых клеток, что является показателем их переключения в сторону более высокой агрессивности. Продолжены исследования экспрессии белков контактов клетка-клетка и клетка-матрикс в клетках линий аденокарциномы яичника, отличающихся по агрессивности фенотипа, а именно SKOV-3 и SKOV-3.ip. Была исследована представленность в клетках E-кадгерина (адгезивные контакты), десмоглеина-2 (десмосомы), коннексина-43 (щелевые контакты), окклюдина и ZO-1 (плотные контакты), а также интегрина бета-1. Показано, что, наряду с представленностью исследованных белков, линии с разной агрессивностью отличаются по их внутриклеточной локализации. Установлено, что в экспериментальных ксенографтных опухолях представленность данных белков на опухолевых клетках зависит от локализации опухоли (подкожная или интраперитонеальная), что отражает влияние формируемого в разных локализациях микроокружения на фенотип опухолевых клеток: в случае подкожной локализации прививаемые клетки оказываются окружены плотно упакованными эпителиальными клетками и большим количеством белков внеклеточного матрикса, тогда как при интраперитонеальной локализации клетки омываются богатой иммунными клетками интраперитонеальной жидкостью, не испытывая ограничительных условий, задаваемых эпителиальной тканью. Исследование устойчивости опухолевых клеток к негативным факторам среды и терапевтическому воздействию, опосредованной взаимодействием с внеклеточным матриксом, будет продолжено на следующем этапе выполнения проекта.