Межвидовые взаимодействия в микробных сообществах и растительно-микробных ассоциациях естественных и техногенных экосистем (генетические, биохимические и биотехнологические аспекты)

Объекты исследования: природные бактериальные изоляты, выделенные из различных экотопов спелеосистем Южного Урала и Северного Кавказа, а также почв, загрязненных нефтью или отходами химического производства; чернозем выщелоченный; растения ячменя, суданской травы, могара; генные сети трингерного типа; штамм Еscherichia coli JC-158. Цели работы: 1. Выделение из природных и техногенных экосистем новых штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и хлорароматических соединений, изучение их свойств, а также способности к очистке различных объектов от загрязнения нефтью и хлорфенольными соединениями; 2. Оценка влияния коллекционных и новых штаммов бактерий на рост и развитие растений; 3. Изучение динамического механизма фазовых вариаций у бактерий на основе мультистабильных управляющих генных сетей, а также анализ распределения Арг-Х протеолитической и ингибитор-трипсиновой активности в клетке Escherichia coli в процессе роста периодической культуры; 4. Характеристика новых штаммов хитинолитических бактерий из различных экотопов пещер Южного Урала и Северного Кавказа. Методы исследования: микробиологические, биохимические, молекулярно-генетические, спектрофотометрические, микроскопические, хроматографические, колориметрический, гравиметрический, компьютерное моделирование, метод обобщенных пороговых моделей для анализа прокариотических систем управления экспрессией генов. Использованная аппаратура: ламинарный бокс ЛБ1К и Gelaire TC48, шейкер-инкубатор с термостатируемой камерой и возможностью охлаждения, термостатируемый встряхиватель П-5.10–Э5960 и УВМТ-12-250, твердотельный термостат Biosan, световые микроскопы AxioImager A1 и Amplival 30-6048a, Leica DM 1000 с цифровой камерой, сканирующий электронный микроскоп TESCAN Vega 3 SBH и сканирующий зондовый микроскоп Solver PRO-M, стерилизатор паровой ВК-75-01, термостат УТУ-2, центрифуга для микропробирок MiniSpin, центрифуга Eppendorf 5415, амплификаторы «My Cycler», Applied Biosystems 2720 и Mastercycler, автоматический секвенатор «ABI PRIZM 3730», трансиллюминатор ECX-F15, электрофорезная камера с блоком питания BioRad, цифровая камера Fuji, ультразвуковой гомогенизатор УЗДН-2Т, шкаф сушильный электрический ШС-40, весы лабораторные электронные «Масса ВК 300», баня комбинированная лабораторная БКЛ, мешалка лабораторная типа ЛМ, рН-метр PH-016A, экстрактор Сокслета, нагреватель для колб типа НК, спектрофотометры СФ-46, СФ-56, SmartSpec 3000 и Unico 2800, вакуумный испаритель «Concentrator 5301», стеллаж для выращивания растений со светодиодной подсветкой, хроматографическая система низкого давления с коллектором фракций, газо-жидкостной хроматограф «Кристалл Люкс 4000», жидкостной тандемный хромато-масс-спектрометр LCMS-IT-TOF «Shimadzu», микроколориметр МКМФ-02. Результаты работы Из нефтезагрязненной почвы выделено 7 штаммов бактерий рода Pseudomonas, обладающих значительной окислительной активностью по отношению к углеводородам различных классов, товарной нефти и дизельному топливу (66-138 мг CO2/г субстрата). Микроорганизмы способны к азотфиксации, растворению неорганических фосфатов, продукции индолил-3-уксусная кислоты (ИУК) в количестве 305-1617 нг/мл культуральной жидкости, а также устойчивы к воздействию ионов свинца в концентрации 1,5-2,0 г/л. Обработка штаммами семян ячменя приводила к увеличению суммарной длины корней на 20,9-33,1% и стимулировала рост побегов на 2,7-18,0%. Биоаугментация углеводородокисляющими микроорганизмами Thalassospira xiamenensis UOM 2, Enterobacter sp. UOM 3, Pseudomonas songnenensis UOM 4 и микробной композицией из этих штаммов чернозема выщелоченного, загрязненного товарной нефтью (50 г/кг), свинцом (Pb2+) (450, 900 и 1800 мг/кг) и их комбинациями, усиливала разложение углеводородов на 6,2-33,8% по сравнению с вариантами без обработки и снижала фитотоксичность почвы, переводя ее в категорию умеренно токсичных. Наличие поллютантов угнетающе действовало на почвенные ферменты, при этом бактеризация способствовала восстановлению ферментативной активности контаминированной почвы за счет повышения уровня каталазной и уреазной активности и, в отдельных случаях, активности инвертазы. Из почвы промышленных экотопов г. Уфы выделено 7 новых штаммов бактерий, способных разлагать фенол и его ди- и трихлорпроизводные. Показано, что наличие атома хлора в 6-й позиции делает хлорированный субстрат более доступным для биоразложения. Из почвы нефтехимического предприятия г. Уфы выделен штамм Serratia marcescens МТ9, разлагающий фенол и 2, 4-дихлорфенол на 82 и 65% за 5 суток культивирования в жидкой среде. В лабораторных условиях установлено, что использование штамма за 5 суток снижает содержание фенола в реальных пробах сточных вод промышленных предприятий на 89,3 и 99,6% при начальных показателях 0,75 и 30,47 мг/л соответственно. Установлено, что обработка штаммами микроорганизмов Pseudomonas sp. UOM 10 и P. hunanensis IB C7, продуцирующими ИУК, приводила к удлинению корней проростков на 8,3-20,7% и повышению энергии и дружности прорастания семян суданской травы, соответственно, на 6,7-9,3 и 6,0-8,6% в сутки. Бактеризация снижала зараженность семян корневыми гнилями и альтернариозом на 20,0-27,5%, уменьшала развитие данных болезней на 9,5-10,5%, увеличивала сырую и сухую массу побегов на 9,5% и на 13,6-20,7% соответственно. Обработка штаммом P. hunanensis IB C7 способствовала возрастанию сырой и сухой массы корней проростков суданской травы на 7,2 и 11,0% соответственно. В вегетационном опыте показано, что инокуляция штаммами Pseudomonas sp. UOM 10 и P. hunanensis C7 стимулировала всхожесть семян растений могара на 5,3%, увеличивала массу их побегов (сырой – на 3,4-7,3%, сухой – на 9,5-13,3%,) и корней (сырой и сухой – на 13,8-15,8%), способствовала ускорению отрастания надземной части растений после обрезки, что проявлялось в увеличении массы побегов (сырой – на 5,9-8,8%, сухой – на 10,6-15,9%) и корней (сырой – на 8,4-16,1%, сухой – на 19,5-21,9%). Лучшие результаты достигнуты при использовании штамма P. hunanensis IB C7. Бактеризация приводила к повышению суммарного содержания хлорофиллов a и b в растениях могара через 30 суток после начала эксперимента на 13,1-21,1%, через 21 сутки после скашивания – на 5,6-11,7%. В математических моделях исследованы новые схемы генных сетей трингерного типа с потенциалом управления фазовыми вариациями у бактерий. Проведен бифуркационный анализ триггерно-осцилляторной системы, образующей основной регуляторный контур трингеров, в условиях, имитирующих экспоненциальную и стационарную фазы роста бактериальной популяции. Выявлены критические значения скоростей синтеза и деградации мРНК и белков отдельных генов, при прохождении которых происходит качественное изменение динамики системы, с которым связано возникновение эпигенетической гетерогенности популяции в экспоненциальной фазе роста. Показано, что локализация в клетке и соотношение Арг-Х протеиназной и трипсин-ингибиторной активностей зависят от смены фаз роста периодической культуры E. coli. Арг-Х протеазы, прочносвязанные с цитоскелетными структурами, находятся под контролем ингибиторов на всем протяжении роста периодической культуры, что отражает защитную роль ингибиторов протеиназ в поддержании целостности нуклеоида. Из различных экотопов пещеры Шульган-Таш (Южный Урал) выделены хитинолитические бактерии, среди которых наибольшей деструктивной активностью обладают психрофильные представители видов Janthinobacterium lividum и Mucilaginibacter rigui (водные источники), а также мезофильные штаммы родов Bacillus и Streptomyces (стены). Уровень ферментативной активности Streptomyces spp. составлял 0,15-0,25 ед/мл, штаммов J. lividum – 0,14-0,18 ед/мл. Наиболее высокая секреция хитинолитических ферментов (0,45-0,50 ед/мл) при глубинном культивировании наблюдалась у штамма M. rigui ST-XaR-1. Кроме того, штаммы Janthinobacterium spp. способны к образованию пигментов классов виолацеина и продигиозина, а также синтезу ИУК (56,0-84,5 нг/мл). В грунте пещер Северного Кавказа (Новоафонская и Шеки-Хиех) обнаружены термоактиномицеты Laceyella spp., а также представители рода Bacillus, способные к деградации хитина. Область применения. Полученные результаты служат базой для дальнейших исследований по разработке биотехнологий для очистки и восстановления окружающей среды от различных ксенобиотиков (нефти, нефтепродуктов и хлорароматических соединений) и создания биопрепаратов комплексного действия для растениеводства. Результаты модельных экспериментов могут быть использованы для управления по критическим параметрам активностью искусственных и гипотетических природных трингерных систем с вариабельной экспрессией генов у бактерий в эколого-генетических исследованиях. Данные о пространственно-временной локализации Арг-Х протеазной активности в положительно заряженных фракциях белков при смене фаз роста культуры E. coli могут быть использованы в качестве модулятора регуляторных путей в управлении клеточным метаболизмом в биотехнологических процессах. Сведения, полученные при изучении микробиоты спелеосистем, могут быть применены для разработки критериев экологического мониторинга процессов микробной сукцессии в экосистемах пещер Южного Урала и Северного Кавказа и оценки скорости биодеградации естественных субстратов в спелеосистемах. Новые микробные изоляты, в т.ч. представители термофильной и психрофильной микробиоты, могут быть использованы как источники новых хитиназ, перспективных для биотехнологического применения и изучения структурно-функциональных особенностей их каталитического действия.