Новые приложения долгоживущих спиновых состояний: релаксометрия с переключением магнитного поля и динамическая поляризация ядер. Этап 3 (заключительный)

Решены задачи по развитию экспериментальных методов генерации и регистрации долгоживущих спиновых состояний и долгоживущих спиновых когерентностей (ДСС и ДСК) в ультранизких магнитных полях. Если магнитное поле настолько низкое, что гетероядра становятся сильно связанными, то наблюдаются гетероядерные ДСС и ДСК. Предложены и апробированы экспериментальные протоколы для исследования различных медленных процессов с использованием ДСС, например, изучение диффузии, а также специфического связывания мелких молекул-метаболитов к белку. Выполнено исследование влияния эффектов «сильной» связи спинов на поведение кривых релаксационной дисперсии. Предложена теоретическая основа для описания спиновой динамики, обусловленной когерентным перемешиванием спинов на антипересечениях уровней. 1. Измерены времена жизни долгоживущих спиновых состояний для четырех протонов в широком диапазоне магнитных полей в дианионе лимонной кислоты в D2O. Обнаружено, что в каждой двухспиновой сильно связанной системе протонов (СН2) в полях ниже 0.3 Тл время жизни синглетного состояния почти в 10 раз длиннее, чем время Т1 релаксации. Таким образом, применение синглетного состояния протонов дианиона лимонной кислоты, имеющего намного более длинное время жизни в более слабом поле, чем в поле ЯМР спектрометра, открывает возможность для изучения специфического связывания этого метаболита с белковыми макромолекулами, изучение которого запланировано на третий год выполнения проекта. 2. Поведены исследования долгоживущих состояний изотопомеров (13СH2,13CD2) ионов малоновой кислоты, обогащенной изотопом 13С в метиленовом фрагменте. В группе СН2 в сильном поле время продольной релаксации спина углерода составило 3 секунды, а поле 30 нТл в релаксации проявляются долгоживущие моды с временем 6.4 секунд. Более того, наблюдается искажение спектра и появление синглет-триплетного дисбаланса населенностей, спектрально проявляющегося в ненулевой разности интенсивностей между двумя крайними линиями триплета. В релаксации группы СD2 наблюдается противоположная тенденция - в сильном магнитном поле время Т1-релаксации очень длинное (23 секунды), а в магнитном поле 30 нТл, где реализуется сильная связь между спинами ядер с дейтериями и ядром углерода, время релаксации спина углерода существенно сокращается (почти в 40 раз) до0.6 секунды. 3. Изучено формирование долгоживущих состояний в системе AX3, в ацетате натрия, обогащенного изотопом 13С в метильной группе, приобретенного французскими партнерами. Для этого методом ЯМР высокого разрешения с переключением магнитного поля детально изучена кинетика неравновесной поляризации ядер 1Н и 13С для индивидуальных компонент квартета и дублета. В кинетике релаксации при совместном фитировании 1Н и 13С были выявлены три временных параметра, один из которых был отнесен к кросс-релаксации, а два другие описывали релаксацию долгоживущего состояния и быструю релаксацию. Для выявления гетероядерного синглетного состояния (STI) с помощью синглет-триплетного дисбаланса населенностей оказалось достаточно использования суммы только двух экспонент с показателями 3.4 с и 5.8 с. Для построения несимметричной составляющей, отвечающей за STI, нами использовалась разность между левой частью мультиплета и правой: С1+С2-С3-С4 для углеродов и Ha-Hb для протонов. Обнаружили, что STI формируется только в ультраслабом магнитном поле (например, в 200 нТл), соответствующем сильной связи гетероядер. Для спиновой системы 13CD3 дейтерированного ацетона в ультраслабых полях, также наблюдается сокращение времени релаксации ядер 13С с 60с до 4с при понижении магнитного поля. Долгоживущих состояний в ультраслабых полях не обнаружено, соответственно и наблюдаемые когерентности тоже не проявили долгоживущего поведения. 4. Проведены ЯМР эксперименты по измерению коэффициентов диффузии с использованием долгоживущих синглетных состояний дипептида аланил-глицина и длинных времен релаксации ядер фосфора мономера РНК цитидинмонофосфата с использованием быстрого переключения магнитного поля и протокола DOSY. Времена Т1-релаксации ядер фосфора в поле 1 Тл и 9.4 Тл отличаются в 2.6 раз. Использование слабого магнитного поля в DOSY-экспериментах позволяет увеличить время Δ с 0.9с до 8 с и уменьшить длительность градиентного импульса δ с 5 мс до 0.65 мс. Коэффициенты диффузии D молекулы цитидинмонофосфата, измеренные с помощью различных экспериментальных протоколов в полях1Тл и 9.4 Тл совпали в пределах экспериментальной точности. В реализованной нами постановке эксперимента для измерения коэффициента диффузии с применением долгоживущих синглетных состояний в пептиде между 90-градусными импульсами последовательности стимулированного спинового эха применяются APSOC-импульсы (Adiabatic Passage Spin Order Conversion), генерирующие в сильном магнитном поле синглетное состояние протонной пары молекулы аланилглицина. Последующий перенос образца в слабое магнитное поле с амплитудой ≤ 0.1 Тл позволяет увеличить время Δ в 10 раз для исследования диффузионных процессов. 5. В результате проведенной работы измерены времена релаксации Т1протонов СН2 аланилглицина и цитрат иона при различных концентрациях белка – человеческого сывороточного альбумина. Доказан факт связывания молекул с белком, предложена объемлющая теоретическая модель хорошо описывающее время релаксации Т1 и TLLS с общим набором параметров. Показано, что релаксационный контраст за счет связывания белка с лигандом на 10% выше для времени релаксации синглетного порядка. Подготовлена статья для отправки в профильный рецензируемый журнал уровня PCCP Q1. Предложенная модель позволяет изучать связывание лиганда с белком измеряя время релаксации синглетного порядка пар протонов, которые не перекрываются с другими сигналами за счет использования Т00 фильтра, то есть на стадии отфильтровываются только сигналы, проходящие через синглетный порядок. 6. Дополнительно к заявленному плану Родиным Б. совместно с руководителем французской группы была проведена теоретическая работа по исследованию механизмов релаксации в условиях, когда система сильно поляризована, или же находится далеко от состояния термического равновесия. Самый яркий пример таких ситуаций – гиперполяризованные субстраты с большим значением поляризации, которые можно произвести в ДПЯ экспериментах. Также такие ситуации могут возникать при переносе намагниченности в ультраслабые поля, когда изначально слабая поляризация, присущая ЯМР спектроскопии в принципе, становится намного больше еще более маленького значения термической намагниченности в новом магнитном поле. Теория релаксации Редфилда, повсеместно использующаяся в ЯМР, может дать некорректный результат при описании эволюции гиперполяризованной системы в силу физических предположений, которые в ней использовались (малый порядок), поэтому была рассмотрена возможность использования теории Линдблада. Было показано, что формализм Линдблада можно вывести из похожих постулатов теории Редфилда, однако нужно предположить квантовую природу взаимодействия ядерных спинов и термостата решетки, а также то, что операторы термостата не коммутируют между собой. Дополнительно было показано, как при помощи симметризации квантовых корреляционных функций найти отношение теории Редфилда и теории Линдблада: за счет выявления явной температурной зависимости после симметризации, релаксационный оператор Линдблада переходит в Редфилда в пределе бесконечной температуры. Соответственно, можно оценить значимость "поправок" Линдблада за счет вычисления температурных поправок. Это позволяет сделать вывод, что при описании систем, далеких от термического равновесия, коими являются системы в экспериментах Динамической Поляризации Ядер, обязательно нужно пользоваться описанием релаксации Линдблада.