ПРОВЕДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В ходе выполнения первого этапа Проекта мы вырастили два культурных сорта и два диких вида нута с яровизацией и без нее. Для культурного нута (Cicer arietinum) были отобраны сорта с разным временем цветения. Дикий нут включал в себя представителей двух видов: Cicer reticulatum, являющегося предком культурного нута, и Cicer echinospermum, который соответствует критериям вторичного генофонда культурного нута. Яровизация семян проводилась в течение месяца при температуре +4 градуса Цельсия. После высадки в почку растительный материал (листья, апексы побегов) собирали с 7-го дня до начала цветения. Цветение наступало с 20-го по 49-й день после высадки в зависимости от сорта и вида нута. Наиболее существенное ускорение зацветания в ответ на яровизацию наблюдалось у представителя дикого вида Cicer echinospermum и у позднецветущего сорта культурного нута. Всего было собрано 72 образца для 6-ти -10-ти временных точек в трех повторностях. Из всех образцов была выделена тотальная РНК, определена ее концентрация, чистота и целостность методами спектрофотометрии, флуориметрии и электрофореза в агарозном геле. Из выделенной РНК получена кДНК методом обратной транскрипции. кДНК была использована для определения уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Для проведения RT-qPCR были разработаны праймеры для 13-ти ключевых генов цветения нута: CaFTa1, CaFTa2, CaFTa3, CaFTB, CaFTC, CaTFL1a, CaTFL1b, CaTFL1c2, CaTFL1c3, CaSOC1-1, CaSOC1-2, CaAP1, CaLFY. В качестве референсных генов использовали Actin1 (Act1) и elongation factor 1-alpha (EF-1α). По сравнению с запланированным набором генов, мы включили в анализ два гена SOC1, как играющих важную роль в цветении озимых растений, и исключили один из генов TFL1 (TFL1c1), т.к. его последовательности нет в аннотированном геноме нута. Из-за большого объема данных, на первом этапе Проекта мы определили уровни экспрессии 5-ти генов у культурного и дикого нута: CaFTa1, CaFTa3, CaTFL1c2, CaAP1, CaLFY. Измерение уровней экспрессии остальных генов, а также, сравнительный анализ динамики экспрессии дикого и культурного нута с яровизацией и без нее будут выполнены в начале второго этапа Проекта. Наш подход основан на сочетании эксперимента и математического моделирования. Для предсказания особенностей регуляторных взаимодействий в генных сетях нута в ответ на яровизацию, мы разработали динамическую модель, основанную на кинетике Михаэлиса-Ментен. Модель рассматривает базовый регуляторный контур, отвечающий за активацию цветения при яровизации. Этот контур включает гены FT и SOC1, которые предположительно являются прямыми мишенями сигнального пути яровизации, а также конечную цель регуляторного каскада – ген AP1, передающий сигнал к зацветанию гомеозисным генам цветка. Все эти гены являются интеграторами сигнальных путей, и экспрессия каждого суммирует множество взаимодействий. По мере получения нами экспериментальных данных, в это базовый контур будут включены такие взаимодействия, как AP1 с TFL1 и TFL1 c LFY. Анализ теоретической модели показал, что присутствие нескольких генов SOC1 как промежуточных активаторов (свойственное для бобовых) обеспечивает более эффективную активацию AP1 геном FT и «фильтрацию» вариабельности экспрессии FT. Далее, мы валидировали наш модельный подход, используя недавно опубликованные данные по экспрессии генов при яровизации у другого представителя бобовых - люцены Medicago trancatula. Данные представляли собой динамику экспрессии FTa1, SOC1a, SOC1b, SOC1c и гена PIM (ортолога AP1), оцененную с помощью RT-qPCR. Так как на тот момент данные по нуту еще были на стадии получения, мы посчитали, что эта динамика даст возможность оценить применимость разработанной нами модели к результатам эксперимента. Мы протестировали четыре модели, реализующие различные сценарии регуляции AP1 (PIM): 1) в регуляции участвует FTa1 и все гены SOC1, при этом все гены SOC1 функционально идентичны (имеют одинаковые регуляторные параметры); 2) в регуляции участвуют только гены SOC1, при этом все гены SOC1 функционально идентичны; 3) в регуляции участвуют только гены SOC1, при этом у каждого гена свои регуляторные параметры; 4) в регуляции участвует FTa1 и все гены SOC1, при этом у каждого гена свои регуляторные параметры. В результате, модель 1 показала наиболее точное описание экспериментальных данных и лучшее значение критерия Акаике. Это явилось предсказанием того, что в генной сети люцерны при яровизации FTa1 ответственен за наиболее сильную активацию AP1 (PIM), а гены SOC1 оказывают активирующее влияние, действуя кумулятивно.