Разработка полного цикла производства радиофармацевтического препарата на основе синтетического пептида и радионуклидов Ga-68 и Lu-177 для визуализации и терапии различных типов онкозаболеваний

Таргетная медицина – актуальное направление лечения онкологических заболеваний. Использование коротких пептидов, тропных к определенным рецепторам, экспрессирующимся на поверхности раковых клеток в большой количестве, многообещающая стратегия в данном направлении. Однако короткие пептиды имеют существенный недостаток, заключающийся в низкой стабильности in vivo и соответственно низкой биодоступности. В настоящее время рассматривается большое количество возможных модификации тропных пептидов. В нашей работе на примере короткого пептида, тропного к рецептору GRPR, который в большом количестве обнаружен на поверхности клеток многих типов рака, мы применили способ создания стабильного комплекса за счет встраивания короткого пептида в структуру пептидных кноттинов, которые формируют высокостабильный цистиновый узел, за счет чего они обладают повышенной стабильностью к воздействию температур, протеаз и pH. На основе проведенного исследования с использованием баз данных были найдены 9 кноттинов из числа токсинов животных и растений, обладающих природной повышенной стабильностью (U1-theraphotoxin-Pc1a кноттин из яда паука Psalmopoeus cambridgei; U5-scytotoxin-Sth1a кноттин из яда паука Scytodes thoracica; Lambda-theraphotoxin-Ec2b кноттин из яда паука Eucratoscelus constrictus; Cyclotide psyleio E кноттин-токсин из растения Psychotria leiocarpa; Roseltide rT1 из растения Hibiscus sabdariffa; Cyclotide hyen-G кноттин-токсин из растения Afrohybanthus enneaspermus; alpha-KTx 16.1 из скорпиона Hottentotta tamulus; Imperacalcin кноттин из яда скорпиона Pandinus imperator; BmK NSPK кноттин из яда скорпиона Mesobuthus martensii). На основе кноттинов и короткого пептида, тропного к рецептору GRPR, были созданы 52 структуры, где короткий пептид помещался в различные домены между остатками цистеина. Далее на основе молекулярного докинга был проведен анализ связывания полученных структур с молекулой-мишенью - рецептором GRPR. На основе этого были отобраны 9 структур (на основе кноттина U1-theraphotoxin-Pc1a с коротким бомбезиновым пептидом в положениях между 1 и 2, а также между 5 и 6 остатками цистеина (Pc1a/C1-C2 и Pc1a/C5-C6); на основе кноттина U5-scytotoxin-Sth1a в положения между 1 и 2 остатками цистеина (Sth1a/C1-C2); на основе также кноттина Lambda-theraphotoxin-Ec2b в положении между 1 и 2 цистеинами (Ec2b/C1-C2); на основе растительного кноттина Cyclotide psyleio E в положении между 3 и 4 остатками цистеина (CpsE/C3-C4); на основе еще одного растительного кноттина Cyclotide hyen-G в положении между 4 и 5 остатками (CycG/C4-C5); на основе кноттина скорпиона alpha-KTx 16.1 в положении между 3 и 4 остатками (KTx 16.1/C3-C4); на основе кноттина скорпиона Imperacalcin в положении после 6 остатка цистеина (Imp/C6) и наконец на основе кноттина скорпиона BmK NSPK в положении между 4 и 5 остатками цистеина (BmK/C4-C5), способные связываться с рецептором с области лиганд-связывающего кармана по аналогии с коротким пептидом. После этого для получения 9 пептидов был разработан лабораторный регламент синтеза комплекса DOTA-пептид с использованием твердофазного пептидного синтезатора на основе Fmoc-химии, а также разработаны методики контроля качества и очистки, которые включают хроматографический и масс-спектрометрический анализ. На основе результатов синтеза и целесообразности дальнейшего исследования были отобраны 3 структуры Pc1a/C1-C2, Ec2b/C1-C2 и Sth1a/C1-C2, для которых были проведены анализ стабильности и связывания с целевым рецептором на поверхности клеточных культур, экспрессирующих данный рецептор. Так, при анализе стабильности модифицированных кноттинов в физрастворе все структуры сохраняют степень чистоты >60% при нагревании и >90% при 4°С в течении 168 часов, в то время как чистота короткого пептида за это время снижалась до <50% при 4ºС и до <10% при нагревании. При анализе связывания с клеточными культурами, несмотря на повышенную стабильность отобранных токсинов, способность связываться с целевым рецептором сохранила только молекула Sth1a/C1-C2. Данная структура способна связываться со всеми типами клеточных культур, экспрессирующими бомбезиновый рецептор, и не связывается с культурой, на поверхности которой данного рецептора нет. Структура Pc1a/C1-C2 связывается только с культурой LnCap, при этом открепляется от поверхности клеток через 3 часа. Структура Ec2b/C1-C2 способна связываться с культурой HCT-116, однако она же связывается с культурой CHO-K1, что говорит о перекрестном связывании и отсутствии изначальной нацеленности на бомбезиновй рецептор. В итоге, в процессе реализации первого этапа исследования были отобраны 3 структуры, которые продемонстрировали высокую стабильность и тропность к рецептору-мишени GRPR. Для получения лабораторных образцов структур были разработаны регламенты синтеза и контроля качества. Проанализированы их стабильность и связывание in vitro. Новые структуры послужат перспективным фундаментом для создания радиофармпрепаратов для лечения широкого спектра онкологических заболеваний, связанных со сверхэкспрессией GRPR.