Новые подходы к получению характеристических профилей объектов со сложной матрицей методами хроматографии и электрофореза (этап 3, заключительный)

Характеристические профили биологически активных соединений, получаемые методами газовой и жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза, являются в настоящее время объектом активных биомедицинских исследований в связи с возможностью классификации анализируемых образцов со сложной матрицей по принципу норма/патология, оптимизации лекарственной терапии, выявления диагностических биомаркеров и т.д. В рамках данного проекта продолжены исследования по целевому и нецелевому метаболическому профилированию биологических жидкостей (моча, сыворотка и плазма крови, культуральные среды бактерий и др.), включающие разработку способов подготовки биологических образцов к анализу с применением математических методов обработки многомерных данных и получены следующие результаты: Найдены новые электрофоретические подходы при определении высокополярных и гидрофильных аналитов, содержащих амино- и гидрокси-группы, на синтезированных алкилимидазолиевых ковалентных покрытиях стенок кварцевого капилляра, формирующих режим гидрофильной капиллярной электрохроматографии. Алкилимидазолиевые покрытия оказались перспективными при совместном электрофоретическом определении кислотных и основных лекарственных препаратов. Продолжены электрофоретические эксперименты с синтезированным хиральным модификатором на основе бутилимидазола и β-ЦД, выявлена его роль в составе фонового электролита (ФЭ) при разделении энантиомеров кетопрофена и кеторолака. Для каждой пары энантиомеров рассчитаны константы комплексообразования с положительно заряженным производным β-ЦД. Получены сравнительные оценочные характеристики по внутрикапиллярному концентрированию индивидуальных энантиомеров нестероидных противовоспалительных препаратов. Наибольшие факторы концентрирования достигнуты при сочетании свипинга и динамического рН скачка (~ 390). Изучены аналитические возможности двойных хиральных систем. Наряду с 1-Bu-3-β-CDImOTs в качестве второго хирального селектора использовали: β-ЦД, ГП-β-ЦД, сульфо-βЦД, декстран, амикацин, амоксициллин и ванкомицин. При сочетании 1-Bu-3-β-CDImOTs и ванкомицина факторы энантиоселективности кетопрофена возрастали до 1.66, и при этом происходило обращение миграции энантиомеров. Выявлены дополнительные резервы селективности разделения биологически активных веществ (БАВ) путем модификации стенок кварцевого капилляра новыми мицеллярными полимерами с терминальными катионными группами. Установлена многофункциональность этих полимеров: способность модифицировать стенки капилляра и реализовать режим мицеллярной электрокинетической хроматографии. Для стероидов и биогенных аминов увеличение концентрации полимера в ФЭ привело к росту факторов селективности и эффективности и возможности осуществить онлайн концентрирование аналитов в 30-50 раз. Найдены условия селективного определения 23-х аминокислот методом ОФ ВЭЖХ в виде производных с дансилхлоридом. Совместное определение низкомолекулярных и среднемолекулярных жирных карбоновых кислот достигнуто без дериватизации на полярной стационарной фазе ZB FFAP методом ГХ/МС. Предложена схема подготовки сыворотки крови к анализу. ПО органических кислот составили ~ 0.05-0.10 мкг/мл. Для выявления потенциальных биомаркеров эндометриоза получены метаболические профили аминокислот и карбоновых кислот сывороток крови больных с диагнозом эндометриоз(n=40). В качестве группы сравнения взяты образцы сывороток крови больных с миомой матки (n=43) и онкологической патологией (n=8), предоставленные Национальным медицинским исследовательским центром имени В. А. Алмазова. Для аминокислот с применением дисперсионного анализа выявлены статистически значимые различия (P<0,05) в уровнях аргинина и соотношении площадей аспарагина и глутамина. Результаты независимо подтверждены построением логистической регрессии и методом деревья решений; точность классификации 85%. Проведена хемометрическая обработка профилей карбоновых кислот для 83-х образцов сывороток крови (32 образца – с эндометриозом, 43 образца – с миомой матки, 8 образцов – с онкологией). Для построения классификаторов образцы разделяли на два подмножества: тренировочное (42 образца) и тестовое (41 образец). Лучший результат показал классификатор на основе случайного леса (точность – 80%, чувствительность – 62.5%, специфичность – 90,5%). Методом ГХ-МС выявлены кислоты, вносящие наибольший вклад в различия между исследуемыми группами: уксусная, пропионовая и масляная. Изучены аналитические возможности глубоких эвтектических растворителей (ГЭР) для извлечения биологически активных веществ (БАВ) из лекарственных растений и последующего профилирования. Выявлены перспективы ГЭР на основе холин хлорида в качестве экстрагента, установлена возможность групповой селективности ГЭР в отношении полярных аналитов. Показана возможность сочетания с методом ВЭЖХ-МС. Установлено, что некоторые системы ГЭР не смешиваются с ацетонитрилом, но при подкислении муравьиной кислотой образуют гомогенную систему. При добавлении 4М раствора NaOH происходит образование фазы, являющейся исходной системой ГЭР. Управление растворимостью ГЭР можно использовать для селективного извлечения и концентрирования соединений в одном аналитическом цикле. Методами капиллярного электрофореза изучены возможности профилирования сахаров в режиме косвенного электрофоретического УФ-детектирования. При выборе поглощающей добавки принимали во внимание ее растворимость в ФЭ, стабильность, высокий коэффициент экстинкции и электрофоретическую подвижность. Акридонуксусная кислота (µ=2,41 м2/В*с) мигрировала ближе всего к ЭОП, что указывает на близкую электрофоретическую подвижность по отношению к определяемым углеводам. Найденный режим адаптирован к определению сахаров в продуктах детского питания и тройного сахарного теста в образцах мочи. Результаты сопоставлены с данными ГХ-МС анализа, полученными при определении углеводов в форме триметилсилильных производных, а также с внутрикапиллярной дериватизацией сахаров этил-п-аминобензоатом, разработанной нами для зонного и мицеллярного режимов КЭ. Для получения сравнительных оценочных характеристик реализован также режим мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). Применение внутрикапиллярного концентрирования (стэкинг с усилением поля, стэкинг с водной пробкой, свипинг) обеспечило дополнительное снижение ПО сахаров до 0.12 – 0.27 мкг/мл. Изучены аналитические возможности имидазолиевых ионных жидкостей (ИЖ) для микроэкстракционного концентрирования стероидных горсонов. Для снижения ПО аналитов апробирован режим дисперсионной жидкостножидкостной микроэкстракции (ДЖЖМЭ) с участием имидазолиевых гидрофобных ИЖ. Установлены факторы, влияющие на степень извлечения аналитов в условиях ДЖЖМЭ: природа и концентрация ИЖ и диспергирующего растворителя, рН водной фазы и концентрация соли в растворе пробы, время экстракции. Лучшие результаты по степеням извлечения (85-90%) получены для ИЖ [C6MIm]NTF2 как экстрагента и ацетонитрила как диспергента. Разработан вариант микроэкстракционного извлечения БАВ растительного происхождения с использованием pH-переключаемых ГЭР. На основании ранее полученных результатов выбраны системы ГЭР. Критерии выбора: экстракционная ёмкость, сопоставимая с метанолом, селективность по отношению к полярным БАВ и способность расслаиваться с ацетонитрилом. Последнее свойство и легло в основу предлагаемого подхода. Анализ хроматографических профилей экстрактов до отделения принимающей фазы показал, что ГЭР повышают эффективность извлечения как полярных, так и малополярных соединений на 10-30% по сравнению с метанолом. Наиболее универсальным оказался состав холин хлорид – малоновая кислота. Разработанный подход испытан на ряде других растительных объектов, где системы ГЭР показали аналогичные результаты.