ПЛАТФОРМА ПОИСКА И РАЗРАБОТКИ ТЕРАНОСТИЧЕСКИХ АПТАМЕРНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ (ПОРТАЛ) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ГЛИОМ ЧЕЛОВЕКА (промежуточный, этап 1)

Отчет представлен на 604 страницах, содержит 270 рисунков, 62 таблицы, 217 источников. ГЛИОМА, АПТАМЕР, ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНАЯ ТЕРАПИЯ, ПЭТ/КТ, РАДИОСЕНСИБИЛИЗАЦИЯ, КОНЪЮГАТ/ КОНЪЮГАТ С РАСЩЕПЛЯЕМЫМ ЛИНКЕРОМ, ТАРГЕТНАЯ ТЕРАПИЯ Цель выполнения НИР: Создание и разработка аптамеров, пригодных для диагностики (в том числе визуализации) и терапии (в том числе таргетной) глиом человека. Задачи НИР: 1. Разработка дифференцировочной терапии с использованием аптамеров и нейроиндукторов, обладающих противоопухолевым эффектом на клетки глиомы и с минимальным влиянием на неопухолевые клетки. 2. Разработка конъюгатов с использованием аптамеров, специфичных к мембранным опухолевым маркерам глиомы, для накопления радиофармпрепаратов в опухоли при визуализации ПЭТ для ее последующей визуализации. 3. Создание G-квадруплексных аптамеров и их производных для повышения радиосенсибилизации клеток глиомы при лучевой терапии. 4. Разработка принципа таргетной терапии глиом с использованием комплексов/конъюгатов, состоящих из терапевтической молекулы и аптамера. Основные результаты работы: Работы велись в четырех направлениях платформы по исследованию аптмеров к глиоме человека. В результате были получены следующие результаты: НАПРАВЛЕНИЕ: Разработка дифференцировочной терапии с использованием аптамеров, обладающих противоопухолевым эффектом на клетки глиомы и с минимальным влиянием на неопухолевые клетки. Получены ткани глиом пациентов высокой степени злокачественности (III, IV Grade) с разной степенью инвазивности и анализ их молекулярных характериcтик. Получены клеточные культуры глиом пациентов высокой степени злокачественности (III, IV Grade) с разной степенью инвазивности и анализ их молекулярных характеристик. Разработан вычислительный подход для поиска и оптимизации структуры аптамеров на основе методов машинного обучения (ИИ) по описанию поверхности контакта нуклеиновая кислота-белок. Синтезированы G-квадруплексные олигонуклеотиды/аптамеры bi-(AID-1-T), GR20, Gol1, способные снижать или блокировать пролиферацию клеток глиомы, для выполнения работ в 2024 году. Проведено сравнение чувствительности клеточных культур глиом высокой степени злокачественности (III, IV Grade) к воздействию аптамеров bi-(AID-1 T), GR20, Gol1. Изучена роль эндоцитоза в проникновении аптамеров bi-(AID-1-T) и biG3C (bi-(AID-1-С)) в клетки глиомы человека методом конфокальной флуоресцентной микроскопии (in vitro). Отработана методика сфероидной культуры, полученной из клеточной культуры глиомы пациента. Проанализировано воздействие аптамеров bi-(AID-1-T), GR20, Gol1 на пролиферативную активность сфероидных клеточных культур глиом человека. Показана эффективность композиции GQIcombi (комбинация аптамера и нейроиндукторных молекул) на сфероидных клеточных культурах глиом человека. Оценена антипролиферативная эффективность композиции GQIcombi (комбинация аптамера и нейроиндукторных молекул) на модели глиобластомы (крыса) при одновременном введении факторов в мозг животного. Проведено in vitro исследование возможности дополнения GQIcombi компонентом для вероятного улучшения свойства дифференцировочной терапии. Отработан метод получения клеточных культур из интрамедуллярных опухолей спинного мозга человека. Оценена представленность молекулы поверхностной адгезии CD44 на клетках разной степени злокачественности глиом человека, оценка ее как потенциальной мишени для регулирования пролиферативной активности клеток глиомы. Получена библиотека аптамера Gol для выбора оптимального аптамера. Проанализировано семейство аптамеров Gol на антипролиферативные свойства in vitro с использованием клеточных культур глиом, полученных их опухолевой ткани пациента человека. Выборан лидер-аптамер семейства Gol, обладающего антипролиферативными свойствами при воздействии на клеточные культуры, полученные из глиом пациентов. Проведен поиск оптимального метода контроля качества синтетического G- квадруплексного олигонуклеотида (bi-(AID-1-T). Выполнен дизайн структуры аптамеров (bi-(AID-1-T)), включая вариации однотяжевых участков. Проанализирована возможность использования 1H ЯМР- спектроскопии для изучения пространственной структуры аптамера bi-(AID-1-T). Оценена возможность моделирования комплексов аптамера bi-(AID-1-T) с предполагаемой мишенью PARP1. Выполнен дизайн аптамерной конструкции bi-(AID-1-T) с комплементарными олигонуклеотидами (АККО bi-(AID-1-T)). Выполнен спектральный анализ сборки и стабильности аптамерной конструкции с комплементарными олигонуклеотидами (АККО bi-(AID-1-T). Проанализированы сборка и стабильность АККО bi-(AID-1-T) методами ВЭЖХ. НАПРАВЛЕНИЕ: Разработка конъюгатов с использованием аптамеров, специфичных к мембранным опухолевым маркерам глиомы, для специфического накопления радиофармпрепаратов в опухоли при визуализации ПЭТ. Синтезированы G-квадруплексные олигонуклеотиды/аптамеры bi-(AID-1-T), GR20, Gol1 для конъюгирования с радиомолекулой для выполнения работ по ПЭТ/КТ (позитронно-эмиссионная томография, совмещённая с компьютерной томографией) в 2024 году. Создан банк данных нейровизуализации глиальных опухолей, отработка технологии количественного анализа паттернов визуализации глиальных опухолей, оценка взаимосвязи паттернов визуализации глиальных опухолей с экспрессией EGFR/ EGFRvIII и других онкомаркеров. Протестированы две методики конъюгации для получения аптамера с радиоактивной меткой для проведения ПЭТ/КТ исследований. Выполнена конъюгация аптамеров семейства Gol с подтверждением стабильности и чистоты конъюгатов методом ВЭЖХ. Выборан лидер-аптамер из аптамеров семейства Gol для проведения исследований (ПЭТ/КТ) на модельных животных. Подборана оптимальная активность конъюгата аптамер c радиоактивной меткой для эффективной визуализации глиомы в животной модели при ПЭТ/КТ-анализе. Подборан временной интервал между введением конъюгата аптамер c радиоактивной меткой и временем анализа его локализации в опухоли животной модели глиомы при ПЭТ/КТ-анализе. Проведены исследования локализации конъюгатов аптамер c радиоактивной меткой в опухоли на модельных животных с глиобластомой с использованием ПЭТ/КТ/ОФЭКТ томографа. Разработан метод синтеза низкомолекулярных реакционноспособных предшественников радиоактивных трейсеров. Разработан подход к мечению олигонуклеотидов трейсерами на нерадиоактивных моделях низкомолекулярных модифицирующих реагентов. Оценена кинетика введения модифицирующих фрагментов в состав олигонуклеотидов/аптамеров на нерадиоактивной модели. НАПРАВЛЕНИЕ: Создание G-квадруплексных аптамеров и их производных для повышения радиосенсибилизации опухоли при лучевой терапии. Проведены облучение и оценка чувствительности культур глиом на разных этапах культивирования клеток. Выборан этап, на котором лучевая терапия оказывает наибольший эффект. Проведено облучение различными радиационными дозами сферообразующих культур. Проведен сравнительный анализ их чувствительности. Синтезированы G-квадруплексные олигонуклеотиды/аптамеры bi-(AID-1-T), biG3С, способные повышать чувствительность опухолевых клеток к лучевой терапии, для выполнения работ в 2024 году. Оценено воздействие комбинаций аптамеров bi-(AID-1-T) и biG3С на выборку клеточных культур глиомы человека различной степени злокачественности. Оценена чувствительность активно мигрирующих клеток глиомы человека к воздействию комбинации аптамеров bi-(AID-1-T) и biG3С (bi-(AID-1-С)). Оптимизирована схема облучения с использованием методики стажирования. Проведено экспериментальное определение оптимальных временных промежутков между фракциями. Определена эффективность выявленных ранее аптамеров-лидеров/комбинации аптамеров при их использовании в сочетании со стажированным облучением различными дозами. Проведена оценка по клеточной пролиферативной активности. Оценено облучение разными дозами с последующим воздействием аптамеров/комбинации аптамеров на пролиферативную активность и апоптоз сфероидной клеточной культуры, полученной из опухолевой ткани пациентов. Проведен сравнительный анализ результатов облучения сфероидных клеточных культур глиом человека и аналогичных монослойных клеточных культур, полученных из опухолевой ткани пациентов. Проведены эксперименты по оценке контроля качества синтетического G- квадруплексного олигонуклеотида biG3C спектральными и хроматографическими методами. Выполнен дизайн структуры аптамера biG3С (bi-(AID-1-С)), включая вариации однотяжевых участков. Проведен анализ возможности использования 1H ЯМР-спектроскопии для изучения структуры аптамера biG3С (bi-(AID-1-С)). Выполнен дизайн аптамерных конструкций biG3С (bi-(AID-1-С)) с комплементарными олигонуклеотидами (АККО biG3С) (bi-(AID-1-С)). Выполрнен спектральный анализ сборки и стабильности АККО biG3С (bi-(AID-1-С)). НАПРАВЛЕНИЕ: Разработка таргетной терапии глиом с использованием комплексов/конъюгатов терапевтической молекулы и аптамера. Синтезированы G-квадруплексные аптамеры GR20, Gol (Gol1), для конъюгации с терапевтической молекулой для выполнения работ в 2024 году. Разработаны подход и метод синтеза отщепляемых модифицирующих реагентов, содержащих противоопухолевые агенты из ряда ингибиторов клеточного деления (паклитаксел/доксорубицин/монометилауристатин Е). Разработаны подход и метод синтеза конъюгатов олигонуклеотидов/аптамеров с отщепляемыми противоопухолевыми агентами из ряда ингибиторов клеточного деления (паклитаксел/доксорубицин/ монометилауристатин Е). Проведен анализ конъюгатов аптамеров с отщепляемым модифицирующим реагентом, содержащим противоопухолевый агент в качестве антипролиферативной молекулы на клеточных культурах глиом пациентов. Проведен анализ конъюгатов аптамеров с отщепляемым модифицирующим реагентом, содержащим противоопухолевый агент в качестве антипролиферативной молекулы на клетках условной нормы. Проведен сравнительный анализ эффективности конъюгатов аптамеров с отщепляемым модифицирующим реагентом, содержащим разные противоопухолевые агенты в качестве антипролиферативной молекулы на опухолевых клетках глиомы человека. Проанализирована эффективность выбранного лидера конъюгата криптоаптамера/аптамера на сфероидной клеточной культуре глиомы человека. Использованы методики контроля качества синтетических аптамеров спектральными и хроматографическими методами. Построены модели аптамеров анти-EGFR и аптамерных конструкций с комплементарными олигонуклеотидами (АККО) анти-EGFR. Проанализирована возможность использования 1Н ЯМР-спектроскопии для изучения структуры аптамеров анти-EGFR. Оценена возможность моделирования комплексов аптамеров с мишенью – внеклеточным доменом EGFR. Определена термическая стабильность аптамеров анти-EGFR и АККО анти-EGFR. Тематика проекта - переход к предиктивно-превентивной персонализированной медицине, высокотехнологическому здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных), решение проблемы антибиотикорезистентности, изучения мозга с целью разработки и реализации современных нейротехнологий, разработки способов лечения орфанных моногенных болезней, бионическая инженерия, ускоренное развитие генетических технологий, создание методик комплексной реабилитации на различных этапах онтогенеза Областью применения результатов данного исследования является применение аптамеров в терапии и тераностике онкологических заболеваний мозга человека.