Макромолекулярные конъюгаты красителей, содержащие бактерицидные полисахариды, в антибактериальной фотодинамической терапии (1 этап, промежуточный)

Данный проект направлен на разработку новых фотосенсибилизирующих систем на основе антраценовых красителей (АК), амфифильных полимеров (АП) и полисахаридов (ПС) для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей методом антибактериальной фотодинамической терапии (АФДТ). АФДТ – это эффективный метод лечения локальных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, которые устойчивы к действию традиционных препаратов – антибиотиков [1]. Достоинством АФДТ по сравнению с антибиотикотерапией является отсутствие резистентности патогенных микроорганизмов к фотосенсибилизатору (ФС) [2]. В качестве ФС были использованы два АК: анионный краситель флуороновой природы – бенгальский розовый (БР) и катионный краситель фенотиазиновой природы – метиленовый синий (МС). В последнее время БР и МС исследуются в различных странах мира (доклинические, клинические испытания) в качестве ФС препаратов для АФДТ [3]. Преимуществами использования БР и МС по сравнению с димегином, фотодитазином, аласенсом, фталоцианинами и другими фотосенсибилизаторами порфириновой природы – это высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода 1О2 (ФΔ~0,7), собственная бактерицидность, а также низкая стоимость красителей [4, 5]. Однако, антраценовые красители в водных растворах, также, как и порфириновые ФС, при концентрациях выше 1х10-6 М склоны к агрегации, что сказывается на снижении эффективности процесса генерации активного кислорода, и может повлиять на повышение жизнеспособности микробных популяций при использовании метода АФДТ. Ранее нами было показано, что совместное использование порфириновых ФС с амфифильными полимерами (АП) приводит к повышению фотосенсибилизирующей активности ФС, что было показано в in vitro и in vivo экспериментах [6,7]. Кроме того, порфиринсодержащие фотосенсибилизирующие системы, содержащие в качестве дополнительного компонента биологически активные полисахариды, способствуют ускорению регенеративных процессов в ране в сеансах АФДТ [8]. На данном этапе реализации проекта получены ФС системы на основе антраценовых красителей: АК-АП, АК-ПС, АК-АП-ПС. Исследовано влияние амфифильных полимеров (плюроники F108, F127, поливинилпирролидон (ПВП) и полиэтиленгликоль (ПЭГ)) и полисахаридов (хитозан (ХТЗ) и альгинат натрия (АН)) на фотосенсибилизирующую активность БР и МС в модельной реакции окисления органического субстрата – триптофана в воде. Показано, что в присутствии АП эффективная константа скорости (kэфф) фотоокисления триптофана, катализируемого красителями в воде, возрастает на 20-30%. Причем наибольшее влияние на фотосенсибилизирующую активность МС оказывает ПВП, а на БР – плюроник F108. Электростатическое взаимодействие, возникающее между АК и ПС, в частности, в системах БР-ХТЗ и МС-АН, приводит к падению фотокаталитической активности красителей в 1,5-3,5 раза. Добавление третьего компонента – амфифильного полимера в систему АК-ПС способствует восстановлению исходной активности МС и БР. Исследовано влияние АП и ПС на спектральные характеристики (электронный спектр поглощения (ЭСП), спектры флуоресценции, 1Н-ЯМР спектры) антраценовых красителей. Установлено, что взаимодействие амфифильных полимеров с красителями приводит к росту оптической плотности (D) всех полос поглощения БР и МС и интенсивности (I) их флуоресценции. При этом наибольшее влияние и на ЭСП, и на спектр флуоресценции красителей оказывает ПВП, что, скорее всего, связано с наличием сильного гидрофобного взаимодействия, возникающего между МС/БР и поливинилпирролидном. Взаимодействие АК с ПВП также подтверждено с помощью 1Н-ЯМР спектроскопии. Данным методом показано, что для систем МС-ПВП и БР-ПВП наблюдаются сдвиги протонов винильных и пирролидоновых фрагментов полимера в сильное поле на 0,1-0,2 м. д. Для систем БР-ХТЗ и МС-АН ЭСП и спектр флуоресценции АК также меняется, а именно в присутствии ПС в 2 раза понижается D и I флуоресценции красителей, что связано с наличием ионной связи АК-ПС. Добавление АП в систему БР-ПС вызывает батохромный сдвиг полос поглощения и полос флуоресценции БР, также наблюдается рост оптической плотности и интенсивности флуоресценции красителя. Для систем МС-АП-ПС также выявлен рост D и I флуоресценции метиленового синего. Полученные спектральные результаты подтверждают, что АК взаимодействуют с полимерами. Причем амфифильные полимеры способны экранировать взаимодействие красителей с полисахаридами. Методом динамического рассеяния света (ДРС) определен размер частиц систем АК-АП в водном растворе. В присутствии амфифильных полимеров размер частиц красителей (БР и МС) уменьшается в ~ 1,5 раза, что подтверждает факт взаимодействия АК с АП, приводящий к частичной разагрегации бенгальского розового и метиленового синего. Макромолекулярные взаимодействия полимеров с антраценовыми красителями подтверждены методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Методом АСМ показано, что надмолекулярная структура полимера плюроника F108 в присутствии МС/БР меняется. Проведены предварительные исследования эффективности систем на основе АК-АП при лечении модельной полнослойной плоскостной раны методом ФДТ. Показано, что при использовании в качестве ФС систем МС-ПВП и БР-F108 наблюдаются выраженные регенеративные процессы в ране – образование зрелой грануляционной ткани с созреванием сосудов и фибробластов.