Оптимизация биолюминесцентной системы грибов для прикладных биоаналитических и биоимиджинговых технологий

Объектом исследования является люциферин-люциферазная система грибов, аналоги люциферина с улучшенными спектральными характеристиками, а также с полученные помощью направленной эволюции мутантные формы люциферазы грибов. Методы визуализации, основанные на биолюминесценции, получили широкое распространение как в фундаментальных научных исследованиях, так и в биомедицине и биотехнологии. Это связано с тем, что биолюминесцентные репортеры обладают рядом преимуществ по сравнению с более широко используемыми флуоресцентными подходами: практически полным отсутствием фонового сигнала и необходимости светового возбуждения. Биолюминесценция не обладает фототоксичностью, фотообесцвечиванием и вызванными светом физиологическими эффектами по отношению к исследуемым тканям [1,2]. Биолюминесцентная система грибов является автономной и не требует добавления субстрата извне, что делает ее очень перспективной для создания разнообразных инструментов биоимиджинга на ее основе. Однако ее свет по яркости уступает другим широко используемым люциферин-люциферазным системам — светлячка, NanoLuc, Renilla. Помимо этого, до сих пор отсутствуют варианты люциферин-люциферазной системы грибов разных цветов, которые можно было бы использовать для многоцветного люминесцентного биоимиджинга [3]. Для создания более совершенных биолюминесцентных репортеров, пригодных для решения широкого ряда биотехнологических задач, необходима оптимизация биолюминесцентной системы грибов путем улучшения спектральных характеристик как субстрата (люциферина), так и фермента (люциферазы). Целью проекта оптимизация люциферин-люциферазной системы грибов путем получения аналогов люциферина с улучшенными спектральными характеристиками, а также проведения направленной эволюции люциферазы гриба Neonothopanus nambi. Результаты проведенных в ходе проекта исследований будут поспособствовать переходу к генетически кодируемой люминесценции с яркостью, достаточной для применения в областях биомедицинских исследований, синтетической биологии и диагностики заболеваний [4]. Задачи отчетного периода: 1. Изучение ингибиторных свойств ингибирующих аналогов грибного люциферина А-Н и определение констант ингибирования для веществ А-Е. 2. Установление константы Михаэлиса и спектров биолюминесценции для всех отобранных пар аналогов люциферина-люциферазы. 3. Изучение стабильности данных аналогов грибного люциферина в физиологических условиях и сравнение их со стабильностью природного люциферина. 4. Синтез предшественников наиболее эффективных аналогов грибного люциферина (аналогов гиспидина). 5. Определение активности аналогов люциферина в гетерологической системе Pichia pastoris, котрансформированных генами наиболее активных вариантов природных люцифераз грибов (agLuz, nnLuz) и природных гиспидин-3-гидроксилаз грибов. 6. Проверка функциональности комбинации люцифераза/ гиспидин-3-гидроксилаза/аналог гиспидина в системе клеток млекопитающих и/или растений.