Метаболическая инженерия микробных продуцентов для промышленной биотехнологии: получение ценных изопреноидных синтонов из природных стеринов (софинансирование)

Проект направлен на создание научно-технологического задела для промышленной микробиологии, связанной с биоконверсией природных стеринов. Основными задачами Проекта являются создание перспективных для промышленного использования новых генно-модифицированных и трансгенных микроорганизмов, продуцирующих из дешевых и доступных фитостеринов продукты с высокой добавленной стоимостью – изопреноидные синтоны стероидного и инданового ряда. Разработка на их основе биотехнологий нового поколения открывает перспективы создания производства целой линейки важных соединений для фармацевтики, биомедицины, ветеринарии и других отраслей. Особенно актуальным такое производство является для России: обладая неисчерпаемыми природными ресурсами для производства высококачественных фитостеринов (лесохимическая отрасль), наша страна является единственным крупным государством, не имеющим собственного производства полного цикла стероидных препаратов. Несмотря на значительный прогресс в области изучения катаболизма природных стеринов у актинобактерий, остаются значительные пробелы в понимании генетического контроля ключевых этапов окислительной деградации боковой цепи и колец C/D-стероидного ядра у непатогенных видов. Восполнение этих пробелов является необходимым для создания высокопроизводительных рекомбинантных штаммов, способных селективно продуцировать ценные изопреноидные метаболиты. Актуальной проблемой является также расширение арсенала методов для направленной структурной модификации микроорганизмами стероидов и других терпеноидных липидов, таких как оксифункционализация неактивных углеродных атомов, в том числе регио- и стереоспецифическое гидроксилирование гонанового ядра и боковой цепи стеринов. Решение проблемы связано с генетической инженерией микроорганизмов, в том числе, путем экспрессии чужеродных систем стероидогенеза в микробных хозяевах. В задачи Проекта входит получение новых рекомбинантных микробных штаммов, способных конвертировать фитостерины в С22-, С24- и С26-стероиды, в том числе, 9-гидроксированные, и ненасыщенные при С-17(20), а также новых улучшенных промышленных штаммов - продуцентов С19-стероидов и инданонов. Для решения этих задач в микобактериальных клетках будут модифицированы пути окислительной деградации боковой цепи фитостеринов с переключением метаболических потоков в сторону накопления целевых стероидов, а также блокированы нежелательные активности, приводящие к образованию побочных продуктов. Другим направлением исследований является создание (с применением синтетических оперонов) и изучение функциональных свойств рекомбинантных микроорганизмов, экспрессирующих чужеродные системы стероидогенеза. На основе уникального высокопроизводительного цитохрома P450 BM3 из Bacillus megaterium планируется создание микобактериального трансгенного штамма, осуществляющего окислительную деградацию фитостерина с одновременным регио- и стереоселективным 7бета-гидроксилированием стероидов. Кроме того, будут изучены новые стероидные гидроксилазы мицелиальных грибов, обладающие высокой активностью в отношении стероидов андростанового ряда, идентифицированы кодирующие их гены и на основе их гетерологической экспрессии созданы эффективные рекомбинантные микробные продуценты диастереомеров стероидных спиртов (7бета, 11альфа и других). С учетом высокой актуальности проблемы получения эффективных противовирусных препаратов (в том числе против коронавирусов), на основе экспрессии генов микобактериальных монооксигеназ, гидроксилирующих холестерин при С26, будут созданы рекомбинантные микробные продуценты 26-гидроксистероидов, изучены их функциональные характеристики, получены новые производные для биомедицинских исследований. Перспективные для биотехнологического применения рекомбинантные штаммы будут использованы при создании новых биопроцессов – прототипов промышленных биотехнологий. Этапами их разработки будут оптимизация условий роста созданных микробных штаммов и биоконверсии ими фитостеринов, масштабирование от колбочного уровня до уровня лабораторных (или пилотных) биореакторов, отработка режимов ферментации, разработка процедур выделения и очистки целевых продуктов с получением кристаллических субстанций высокого качества. В ходе выполнения проекта будут получены приоритетные научные результаты о генетическом контроле окислительной деградации боковой цепи стеринов и глубокого окисления стероидного ядра (колец C и D), управляемой гетерологической экспрессии чужеродных генов в бактериальных и дрожжевых хозяевах, функциональных особенностях бактериальных и эукариотических цитохром P450-монооксигеназ, осуществляющих регио- и стереоспецифические реакции гидроксилирования стероидов. Комплексное решение фундаментальных задач в области генетической и метаболической инженерии стероидтрансформирующих штаммов и микробиологической трансформации природных стеринов позволит создать научную основу для создания нового поколения микробных продуцентов и инновационных биопроцессов для промышленной микробиологии. Практическая значимость проекта состоит в создании новых эффективных микробных продуцентов и разработке на их основе прототипов промышленных биотехнологий нового поколения, открывающих перспективы создания многоцелевых микробиологических производств, в которых на одной технологической линии возможна продукция из фитостерина целого ряда востребованных продуктов. Залогами успешного выполнения проекта является профессиональная команда исполнителей - специалистов в области молекулярной биологии, генетической инженерии, микробиологии, биотехнологии, химии, а также весомый научный задел по тематике проекта и практический опыт разработки и масштабирования биотехнологий, а также, несомненно, поддержка проекта компаниями, заинтересованными в дальнейшем практическом применении его результатов.