Разработка технологий генодиагностики для персонифицированного лечения ревматоидного артрита и исследование эффективности прототипов средств генной терапии ревматоидного артрита (заключительный), 3 этап.

Настоящий отчет обобщает и систематизирует данные, полученные в результате этапа 3 ПНИ по теме «Разработка технологий генодиагностики и генной терапии для персонифицированного лечения ревматоидного артрита», Шифр заявки «2018-14-000-0001-571», Уникальный идентификатор проекта RFMEFI60518X0003. Основанием для выполнения работы явился Государственный контракт от «13» июня 2019 г. № 075-15-2019-1352 в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы». Объектами исследования являются прототипы геннотерапевтических препаратов для лечения ревматоидного артрита, разрабатываемые в результате применения технологий для предсказания эффективности биологической терапии и исходов ревматоидного артрита на основе анализа генетических и эпигенетических маркеров. Целью работы этапа 3 ПНИ является разработка технологий генодиагностики для персонифицированного лечения ревматоидного артрита и исследование эффективности прототипов средств генной терапии ревматоидного артрита. Для достижения указанной цели, в соответствии с Календарным планом, были поставлены следующие задачи: - исследовать терапевтическую эффективность аденоассоциированных вирусов в модели экспериментального артрита in vivo; - провести анализ генетических полиморфизмов, потенциально связанных с развитием ревматоидного артрита и эффективностью лечения; - разработать и валидировать наборы реагентов для ПЦР-анализа генетических полиморфизмов, связанных с прогнозом развития и лечения ревматоидного артрита; - провести дополнительные патентные исследования; - разработать рекомендации для персонализации терапии ревматоидного артрита Олокизумабом; - проанализировать результаты мультицентрового международного клинического исследования Олокизумаба; - разработать и провести валидацию наборов реагентов для ПЦР-анализа эпигенетических маркеров, связанных с прогнозом развития и лечения ревматоидного артрита. Для выполнения поставленных задач были выполнены экспериментальные исследования в полном соответствии с требованиями Технического задания и Календарного плана. При выполнении третьего этапа ПНИ были получены следующие основные результаты. Исследование терапевтической эффективности аденоассоциированных вирусов в модели экспериментального ревматоидного артрита (РА) in vivo выполнялось в Центре доклинических исследований, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет) в соответствии с U.S. FDA Good Laboratory Practice (GLP) Regulations for Non-clinical Laboratory Studies (21 CFR Part 58), OECD Principles on Good Laboratory Practice (ENV/MC/CHEM (98) 17) и согласно Решению Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств». Кроме того, в ходе исследования были проведены внутренние аудиты PRC-022-phD, не выявившие каких-либо отклонений от протокола исследования. Для проведения исследования была использована модель кроличьего антиген-индуцированного артрита (АИА). Распределенным по группам животным после прохождения карантина и сенсибилизации к овальбумину вводили внутрь правого коленного сустава лекарственное средство на основе аденоассоциированных вирусов в дозе 1011 вирусных частиц в объеме 0,5 мл стерильного физиологического раствора (экспериментальная группа), либо 0,5 мл стерильного физиологического раствора (контрольная группа 1), либо вовсе не проводили вышеуказанных манипуляций (контрольная группа 3). Определение терапевтической эффективности аденоассоциированных вирусов заключалось в измерении диаметра коленных суставов кроликов, определения среднего уровня воспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β, IL-6), характерными для патогенеза РА, а также гистологического изучения патоморфологических изменений коленных суставов. В результате исследования in vivo были показаны различия в диаметре колена кроликов между группами, получавшими и не получавшими препарат на основе вирусных частиц (увеличение примерно с 20 мм до 24 и 26 мм соответственно); изменения уровней цитокинов и гистологические срезы не показали значимых различий между группами. Таким образом, в результате применения препарата AAV-IL10 в модели экспериментального артрита in vivo было отмечено незначительное снижение тяжести вызванного состояния. Характерной особенностью РА является выраженный клинический полиморфизм, заключающийся в широкой вариабельности симптомов, клинических форм и вариантов течения. За отчетный период был проведен анализ полиморфизмов, потенциально связанных с развитием, течением и лечением РА при помощи препарата олокизумаб. Полиморфные варианты были получены в результате NGS-секвенирования таргетной панели, включающей кодирующие части 6 генов IL6 (10 экзонов), IL6R (10 экзонов), TNFRSF1A (10 экзонов), CTLA4 (4 экзона), IL10 (5 экзонов), IL23R (11 экзонов), HLA-DRB1, HLA-B, PADI4, суммарно 46 экзонов, около 90 коротких фрагментов генома с полиморфизмами, локализованными в белок-кодирующих генах, участки 4 локусов HLA, с учетом состава и количества пулов праймеров, предложенных программой AmpliSeq Designer. Секвенирование этой панели позволяет оптимизировать систему потенциальных маркеров предрасположенности к РА и ответу на терапию различными средствами, в том числе гормональными препаратами и с помощью таргетной иммунотерапии. В результате исследования были определены частоты аллелей этих локусов в группе из 125 пациентов клинического исследования CL04041022, рандомизированных в одну из двух групп лечения исследуемым препаратом олокизумабом. При сравнении частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов генов, ассоциированных с предрасположенностью к РА, у исследуемой выборки пациентов с популяционными частотами для европейской популяции (база данных Genome Aggregation Database (gnomAD)) статистически значимые различия (p<0,05) в распределении частот аллелей и/или генотипов наблюдались для полиморфных локусов генов TNF [rs1800629], FCGR2A [rs1801274], IL4 [rs2243250], IL17A [rs2275913], PTPN22 [rs2476601], TPMT [rs2842934], BTNL2 [rs3817963], STAT4 [rs7574865]. Для полиморфизмов генов TNXB [rs17421624] и AIRE [rs760426] отмечалась тенденция к статистической значимости различий (p≥0,05 и <0,1) в распределении частот аллелей и/или генотипов у исследуемой популяции пациентов в сравнении с данными по европейской ассоциации. Также были исследованы ассоциации между частотами генотипов полиморфных вариантов генов и клиническими и другими исходными характеристиками пациентов исследуемой выборки. Полученные результаты были использованы для формирования набора на определение предрасположенности, течения и лечения РА у российских пациентов. В результате статистического анализа ассоциаций между полиморфизмами генов и показателями эффективности терапии препаратом олокизумаб можно выделить полиморфные варианты генов, их аллели и генотипы, которые ассоциированы с повышением шансов на эффективную терапию олокизумабом по нескольким клиническим критериям, или, напротив, ассоциированы со снижением эффективности терапии олокизумабом у российских пациентов с РА. Аллели и генотипы TNF [rs1800629], FCGR2A [rs1801274], IL4 [rs2243250], IL17A [rs2275913], PTPN22 [rs2476601], TPMT [rs2842934], BTNL2 [rs3817963], STAT4 [rs7574865] продемонстрировали достоверные ассоциации с предрасположенностью к развитию РА. Были выявлены полиморфные варианты, аллели и генотипы которых ассоциированы с полом, возрастом, длительностью заболевания, исходным уровнем СРБ, исходным уровнем антицитруллиновых антител, исходным уровнем ревматоидного фактора, а также исходными клиническими характеристиками пациентов, которые определяли по критериям CDAI, DAS28-СРБ, HAQ-DI. Достоверность ассоциаций была подтверждена с использованием нескольких диагностических и прогностических критериев ACR20, ACR50, DAS28-СРБ и HAQ-DI, и ассоциациями с ответом на разных сроках терапии олокизумабом (12 недель и 24 недели). Также наглядно продемонстрировано, что большая часть (67%) генов, в которых обнаружены ассоциированные с ответом на олокизумаб SNP, также имеют аллели, предрасполагающие к тяжелому течению РА. Полученные варианты использованы для разработки диагностического набора «РЕВМАРТРИТ-ПОЛИМОРФ». На основе результатов анализа генетических полиморфизмов, потенциально связанных с развитием РА и эффективностью лечения препаратом олокизумаб, был предложен способ прогнозирования эффективности применения препарата олокизумаб при лечении РА. Результатом исследования явилась заявка на патент «Способ прогнозирования эффективности лечения ревматоидного артрита препаратом олокизумаб на основе генотипирования» (регистрационный номер № 2020131970; Уведомление о приеме и регистрации заявки прилагается). Для оценки генетической предрасположенности к тяжелому клиническому течению РА и эффективности терапии таргетными препаратами, например, новым ингибитором интерлейкина 6 олокизумабом были проанализированы панели маркеров с учетом популяционных особенностей российских пациентов, в результате чего был разработан и валидирован набор реагентов «РЕВМАРТРИТ-ПОЛИМОРФ» для качественного обнаружения in vitro методом ПЦР аллелей и генотипов определенных генов в пробах нуклеиновых кислот, выделенных из клинических образцов (кровь) генетических полиморфизмов, достоверно ассоциированных с прогнозом развития и лечения РА. Для данного набора разработаны инструкция по применению и технические условия; эти документы прилагаются. Участие микроРНК в воспалительных процессах, заключающихся в контроле выработки цитокинов, защите хрящевой ткани за счет регуляции катаболической активности, пролиферации и устойчивости к апоптозу, опосредует их влияние на развитие и клинические проявления РА у пациентов. МикроРНК могут быть детектированы в биологических жидкостях, что позволяет использовать их в неинвазивной диагностике. Так, нами были проанализированы микроРНК (miR-29, miR-16, miR-155, miR-20a, miR-451, miR-26b, miR-522, miR-192, miR-137), которые потенциально могут участвовать в патогенезе РА, в образцах плазмы от 103 пациентов с РА, получавших олокизумаб. По результатам анализа этих эпигенетических маркеров была выявлена корреляция между исходным уровнем относительной экспрессии miR-26b, miR-29 и тяжестью заболевания, а также miR-522 и наличием антицитруллиновых антител. Также показано, что miR-29, miR-451, miR-26b и miR-522 можно рассматривать в качестве биологических маркеров, ассоциированных с эффективностью препарата олокизумаб. Полученные варианты использованы для разработки диагностического набора «РЕВМАРТРИТ-микроРНК» с целью оценки эффективности терапии таргетными препаратами, в частности, новым ингибитором интерлейкина 6 олокизумабом. Данный набор предназначен для профилирования экспрессии микроРНК miR-26b, miR-451 и miR-522, выделенных из клинических образцов (плазма крови), методом ПЦР в реальном времени с последующим сравнением результатов с ранее рассчитанным пороговым значением. Для данного набора разработаны инструкция по применению и технические условия; эти документы прилагаются. Проведено материально-техническое обеспечение экспериментальных работ по этапу 3 за счет внебюджетных средств. Подведены итоги третьего этапа. Разработана и оформлена отчетная документация.