Нанобиотехнологии в диагностике и терапии социальнозначимых заболеваний

Отчет 757с., 1 ч., 392рис.,123 табл., 255источников,9 прил. НАНОЧАСТИЦЫ, АМФИФИЛЬНЫЕ СОПОЛИМЕРЫ, ВЕКТОРИЗОВАННЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, АЭРОГЕЛИ, АНТИДЕПРЕССАНТЫ, ИНТРАНАЗАЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ, ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ, ТРАНСЛЯЦИОННЫЕ, ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ, СИСТЕМЫ СО-ДОСТАВКИ, МОДЕЛИРОВАНИЕ, ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНСУЛЬТ, ДЕПРЕССИЯ, МОДЕЛИ ДЕПРЕССИИ, НЕЙРОПЕПТИДЫ, СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ НЕЙРАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Объектом исследования являются прототипы препаратов для терапии и диагностики социальнозначимых заболеваний. Целями работы являются разработка и создание нового класса терапевтических и диагностических агентов, на основе полимерных наночастиц, содержащих бинарные комбинации терапевтических агентов; разработка принципиально новых методов терапии социально значимых заболеваний с использованием наноструктурированных носителей бинарных комбинаций терапевтических агентов, клеточных продуктов и интраназальных лекарственных форм с улучшенной эффективностью; получение теоретических и экспериментальных данных о механизме доставки наноструктурированных носителей терапевтических и диагностических агентов в головной мозг. В рамках заключительного этапа работ по Соглашению от «09» октября 2020 г. № 075-15-2020-792 партнерами проведены совместные комплексные исследования объектов, разработанных на предыдущих этапах выполнения проекта. Разработаны методы включения бинарных комбинаций (в т.ч. афатиниба и доксорубицина) в наночастицы на основе синтетических биодеградируемых полимеров (полилактидов и сополимеров молочной и гликолевой кислот, PLGA). Описана методика получения основания афатиниба из растворимой формы (афатиниба дималеат), результаты анализа чистоты (спектры 13C ЯМР, 1Н ЯМР и масс-спектры), растворимости и стабильности субстанции. Проведены исследования физико-химических характеристик созданных наноразмерных форм. Для анализа размера и распределения наночастиц по размерам использовали метод динамического лазерного светорассеяния (DLS). Определение ζ-потенциала поверхности наночастиц проводили методами электрофоретического рассеяния света (ELS). Содержание доксорубицина определяли методом спектрофотометрии в УФ области (СФ). Содержание афатиниба в наноразмерных формах определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение содержания полилактида в полимерных наночастицах проводили с помощью капиллярного электрофореза (КЭФ). Приведены сведения о влиянии технологических параметров на основные физико-химические параметры моно-форм доксорубицина и афатиниба на основе PLGA (размер и распределение по размерам, ζ-потенциал поверхности, степень включения лекарственных веществ). Отчет содержит протоколы анализа соответствующих параметров. Система со-доставки афатиниба и доксорубицина обладала размером частиц около 100 нм, отрицательным ζ-потенциалом поверхности, высокой степенью включения (более 90%) и нагрузки (более 3%) нагрузки обоих лекарственных веществ (ЛВ). Проведены исследования высвобождения доксорубицина и афатиниба из наночастиц на основе PLGA/PLA in vitro в модельные среды (1% полоксамер 188, 2% полисорбат 80). В тексте отчета содержатся соответствующие протоколы исследования кинетики высвобождения ЛВ из PLGA наночастиц. Описаны факторы, влияющие на скорость высвобождения афатиниба и доксорубицина из полимерной матрицы. Проведены исследования включения производных клозо-декабората (KD-10, KD-11, KD-12, KD-13, CDC-RhB) в полимерные наночастицы на основе PLGA. Для качественного и количественного анализа анионов клозо-декаборатов KD-10, KD-11, KD-12 была разработана методика на основе метода капиллярного зонного электрофореза. Для анализа количественного содержания клозо-декаборатного кластера KD-13 был применен метод масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS). Для анализа родаминоксидодекабората тетрабутиламмония (CDC-RhB) разработана методика спектрофотометрического определения (СФ). Для полученных наночастиц описаны основные физико-химические параметры (средний размер, степень однородности, ζ-потенциал поверхности) и эффективность включения клозо-декаборатных производных. Отчет содержит протоколы анализа соответствующих параметров. Исследована зависимость включения декаборатного кластера от строения заместителей кластера. Установлено низкое (менее 1%) включение производных KD-10, KD-11, KD-12 в наночастицы, не зависящее от их растворимости в воде и дихлорметане. С помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показано, что производное клозо-декабората KD-13 (2,7-дитетрагидропиранил-клозо-декаборат) в наносуспензии присутствовало в виде нерастворимой крупнокристаллической фракции, что обуславливало кажущуюся высокую степень включения (91,2%) и замедленный профиль высвобождения в водных средах. Полилактидные наночастицы, загруженные конъюгатом родамина Б с клозо-декаборатным комплексом (CDC-RhB) размер частиц около 200 нм, отрицательный ζ-потенциал поверхности (-27 мВ), высокую степень включения (62,3%), однако быстрое высвобождение комплекса в модельной среде. Проведенные исследования in vitro по захвату клозо-декаборатных комплексов в свободном виде и в составе наночастиц клетками линейной глиомы GL261 продемонстрировали необходимость поиска более успешной стратегии включения клозо-декаборатных комплексов в полимерные носители. Проведена оптимизация технологии получения наночастиц, содержащих комбинации лекарственных веществ (доксорубицин, паклитаксел, 4’-О-бензилоксикарбонильного производного этопозида). На основании проведенных экспериментов in vitro по оценке цитотоксической активности химиотерапевтических агентов (доксорубицин, паклитаксел, этопозид, 4’-О-бензилоксикарбонильное этопозида, темозоломид) в свободном виде и их комбинаций в различных соотношениях на линиях клеток злокачественных глиом были установлены наиболее эффективные комбинации ЛВ для изучения эффектов взаимодействия при их введении в виде систем со-доставки. Системы со-доставки 4’-О-бензилоксикарбонильного производного этопозида (ETP-Cbz) и паклитаксела на основе человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и PLGA с массовым соотношением ЛВ 1:1 продемонстрировали синергетический эффект в эксперименте in vitro на клетках линейной мышиной GL261 и нейробластомы Neuro-2a (индекс взаимодействия < 0,9), что свидетельствует о перспективности данной формы для терапии злокачественных глиом. В отчете приведены лабораторные методики получения и акты о наработке образцов наночастиц данного типа (моно-формы и системы со-доставки). С использованием разработанных и оптимизированных методик были изучены основные параметры полученных наночастиц (распределение по размерам, ζ-потенциал, содержание ЧСА, содержание PLGA, степень включения и нагрузки ЛВ). Отчет содержит протоколы анализа соответствующих параметров. В эксперименте на трех линиях линейных глиом человека и первичных культурах глиобластом от пациентов были показаны различные эффекты (в большинстве случаев, антагонистические) от совместной доставки паклитаксела и доксорубицина в составе PLGA наночастиц. В отчете приведены лабораторные методики получения и акты наработки образцов наночастиц, содержащих паклитаксел и доксорубицин в массовом соотношении 1:1. Тем не менее, для всех рассмотренных типов клеток глиом отмечена более высокая цитотоксичность моно-форм доксорубицина на основе PLGA по сравнению с доксорубицином в свободном виде. Проведены расширенные биологические испытания для оптимизации моно-формы доксорубицина. В отчете описаны основные результаты проведенных экспериментов in vivo по оценке биораспределения при однократном внутривенном введении и взаимодействия с компонентами крови (иммунные клетки) наночастиц, содержащих доксорубицин и флуоресцентную метку (Cy5). Выявлено, что оптимальной с точки зрения технологии получения, биофармацевтических свойств и поведения in vivo является форма со степенью включения около 90% и средней скоростью высвобождения доксорубицина в модельной среде (около 30%, 50% и 60% через 24, 48 и 96 ч, соответственно). Была продемонстрирована способность PLGA наночастиц данного типа эффективно доставлять доксорубицин в ядерную ДНК клеток глиомы GL261 в эксперименте in vitro. В тексте настоящего отчета также содержится лабораторная методика получения и акт о наработке образцов нагруженных доксорубицином наночастиц с оптимальными характеристиками на основе PLGA. В тексте отчета также содержится информация о разработке альтернативных подходов к химиотерапии опухолей мозга (формы для локальной терапии), а также синтезе новых молекул противоопухолевых агентов. Проведены исследования in vitro и in vivo наносомальных форм на основе амфицильных полимеров доксорубицина и паклитаксела, а также модельного препарата индометацина, которые показали, что такие формы преимущественно накапливаются в печени и почках, а также по данным МРТ могут в небольшой доле проникать в головной мозг и обладают временем циркуляции в организме большим, чем лекарства не включенные в наноразмерные агрегаты. Оптимизированные наносомальные формы на основе амфифильного сополимера N-винил-2-пирролидона и акриловой кислоты, содержащие иммобилизованные доксорубицин и паклитаксел, имеют выраженную противоопухолевую активность в отношении глиальной клеточной линии С6. Из числа оптимизированных образцов наибольший эффект достигнут при мольном соотношении доксорубицина и паклитаксела 1/1. Показано, что амфифильный сополимер N-винил-2-пирролидона и акриловой кислоты не проявляет выраженной токсичности и может быть рекомендован в качестве носителя. Сформированы теоретические и практические основы фармацевтической разработки сухих назальных спреев на основе биополимерный аэрогель с внедренной АФС; исследована стабильность формуляций сухих назальных спреев на основе аэрогелей; проведены предварительные доклинические исследования сухих назальных спреев. Разработаны модели фармакокинетики и фармакодинамики; проведено тестирование и оценка эффективности информационной системы подбора композиций лекарственных средств; осуществлена разработка мультимасштабной модели для «обратного инжиниринга» свойств формуляций лекарственных средств на основе аэрогелей; выбрано дозирующее устройства для сухих назальных спреев, которое позволит обеспечить точность дозирования и однородность распределения при каждом применении. Получены конъюгаты магнитных и полимерных наночастиц с синтетическими олигосахаридами фукоиданового ряда. Показано специфическое взаимодействие векторизованных наночастиц с клетками. На ортотопической аллогенной модели опухоли глиобластомы крысы С6 и на ксенографтной ортотопической модели опухоли глиобластомы человека U87 показано повышенное накопление векторизованных наночастиц при помощи МРТ in vivo по сравнению с контрольными образцами. Таким образом можно утверждать, что полученные синтетические олигосахариды являются переспективной векторной молекулой для доставки в опухоли головного мозга. Показано, что использование наноструктурированных носителей на основе аэрогелей из хитозана и белка для интраназальной доставки антидепрессантов в головной мозг приводят к увеличению терапевтического эффекта, а в случае наночастиц более высокую терапевтическую эффективность показала и комбинация препаратов. Разработана модель ГЭБ, которая была использована для оценки способности наночастиц проникать через ГЭБ in vitro. Показано отсутствие токсического воздействия наночастиц PMC16, загруженных 25Mg на мезенхимальные стволовые и нейральные прогениторные клетки. На модели ишемического инсульта крысы показана эффективность бинарной терапии с использованием МСК и НСК. Подобраны пути и дозы введения клеток, способствующие минимизации побочных действий. Показана эффективность терапии модели ишемического инсульта при помощи наночастиц PMC16, загруженных 25Mg. Проведены исследования фармакокинетики наночастиц PMC16 и показана их способность доставлять магнитный изотоп 25Mg в головной мозг при внутривенном введении. Разработана и валидирована модель фармакокинетики наночастиц PMC 16 после внутривенного введения. Проект находится на завершающем этапе разработки. Работы выполнены на высоком научно-техническом уровне, полученные результаты соответствуют мировому уровню. Полученные технические решения обладают научной новизной и практической значимостью, что подтверждается публикациями в высокорейтинговых научных журналах и поданными заявками на регистрацию РИД. Результаты, полученные при выполнении заключительного этапа работ, рекомендованы к использованию в качестве исходных данных для разработки и реализации дальнейших прикладных поисковых исследований и разработки технического задания на НИОКР. Разрабатываемые прототипы препаратов предназначены для терапии и диагностики социальнозначимых заболеваний.