Молекулярно-клеточные механизмы онкологических, иммунных, метаболических заболеваний, моделирование и экспериментальное обоснование методов репрограммирования и онкотаргетинга

Отчет 521 стр., 198 рис., 39 табл., 320 источника, 1 приложение. ОНКОТЕРАНОСТИКА, ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, РЕПРО-ГРАММИРОВАННЫЕ Т-ЛИМФОЦИТЫ, МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ, ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ПРОТЕАСОМА, МИКРООКРУЖЕНИЕ ОПУХОЛИ, ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК Цель работы: Исследование фундаментальных проблем клеточной биологии, связанных с развитием опухолевой трансформации, аутоиммунных реакций, метаболических клеточных аномалий, а также разработка на основе полученных фундаментальных знаний инновационных подходов к диагностике и терапии онкологических, иммунных, метаболических заболеваний человека. В 2022 году были проведены исследования по 9-ти направлениям и получены следующие основные результаты: 1. В рамках разработки фундаментальных основ Т-клеточного реинжиниринга, изучения микроокружения опухоли и ионных каналов при опухолевой трансформации: разработан «Протокол репрограммирования Т-лимфоцитов с использованием методов РНК-интерференции для лечения рака лёгкого», установлены сигнальные пути, запускаемые в раковой клетке при активации протон-чувствительных каналов, определена молекулярная мишень мамбалгина-2 в опухолевых клетках; найдены модуляторы депо-управляемого входа кальция (Лефлуномид, Терифлуномид и 4-МРТС), подавляющие пролиферацию раковых клеток; установлено, что при длительном культивировании Т лимфоцитов человека, модифицированных DNaseI-P2A-HER2-CAR наблюдается значительное снижение выживаемости и количества CAR клеток по сравнению с контролем. 2. В рамках генетическго профилирования активированных цитотоксических Т-лимфоцитов, обладающих заданной функциональной активностью (патогенной ауто-иммунной, онколитической, противовирусной) была показана принципиальная возможность идентификации TCR CTL и создания на их основе искусственных цитоток-сических Т-лимфоцитов, модифицированных TCRv-CAR. В то же время полученная методология требует дальнейшего принципиального улучшения с точки зрения эффективности разработанных TCRv-CAR-T клеток. 3. В рамках создания надмолекулярных комплексов для адресной терапии онкозаболеваний: на основе молекулярной пары барназа-барстар и скаффолдных пептидов, специфичных к прогностически значимым опухоль-ассоциированным антигенам, разрботана модульная система для CAR-T терапии с контролируемой цитотоксичностью на основе универсального Т-клеточного рецептора; для доставки лекарств к первичным солидным опухолям и метастазам на основе высокопористых наноконтейнеров, нагруженных химиопрепаратом, разработана принципиально новая концепция, основанная на мгновенном высвобождении лекарства из высокопористого носителя, способного быстро разрушаться в кровотоке; рзработан фотоакустический метод детекции биодеградации наночастиц, необходимый при разработке и тестировании биодеградируемых материалов в клинических исследованиях. 4. В рамках исследования механизмов формирования внутриопухолевой гетерогенности глиобластом и опухолевого рецидивирования: на основе полученных экспе-риментальных данных постулирован механизм формирования внутриопухолевой гетерогенности глиобластом, который связан с закислением микроокружения в процессе роста опухоли и возникновением изоформы RPL22L1b, способствующей поддержанию более агрессивного мезенхимального фенотипа клеток глиобластомы; изучен феномен «выживания» незначительной части опухолевой популяции после эффективной противоопухолевой терапии с помощью транскриптомного и протеомного анализа молекулярных сигнальных систем и компонентов везикулярного транспорта (экзосом) в сохранившихся опухолевых клетках. 5. В рамках развития фундаментальных основ структурно-биологического мембранного онкотаргетинга и внутриклеточного имиджинга: создана методика, описывающая основные принципы по созданию технологии структурно-подкрепленного мембранного онкотаргетинга; на основе разработанных авторами проекта генетически кодируемых флуоресцентных зондах создана первая в мире технология LiveMIEL для анализа изменений эпигенома в живых клетках в динамике и со сверхвысоким разрешением. 6. В рамках исследования молекулярно-генетических основ опухолевого пере-рождения и метастазирования, резистентности к лекарственным средствам: для детекции ранних стадий онкозаболевания создана in vitro система, позволяющая детектировать и изучать хромосомные аберрации сразу же после их образования; с использованием метода CRISPR-Cas9 на базе линии HEK293 создан уникальный набор клеточных линий, нокаутных по генам белков-участников системы репарации ДНК и белковых факторов, регулирующих работу этой системы, что позволяет выявлять функции белков, участвующих в регуляции систем репарации ДНК в клетках человека; найдены новые ингибиторы фермента репарации ДНК тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 чело-века из различных классов природных соединений, которые могут быть применены для разработки препаратов, сенсибилизирующих действие противоракового препарата топотекана. 7. В рамках исследования роли врожденного иммунитета в супрессии процессов опухолевой трансформации: установлено, что ключевым моментом действия цитокина IL-2 на цитотоксическую активность CD8+-Т лимфоцитов является генерация субпопуляции CD8+ CD25+ -несущей на цитоплазматической мембране белки, обусловливающие появление цитотоксической активности (специфическое связывание лимфоцитов с клеткой-мишенью, стабилизация такого бинарного межклеточного комплекса, индукцию цитотоксических сигналов программированной клеточной смерти); разработана in vitro платформа, позволяющая получать генетически модифицированные макрофаги (модМФ) из иПСК (клеток с индуцированной плюрипотетностью человека) для изучения внутриклеточных механизмов регуляции про- и противовоспалительной активности фагоцитов, моделирования воспалительных заболеваний и разработки новых подходов к их терапии. 8. В рамках изучения регуляции клеточного метаболизма при опухолевой транс-формации и старении: исследовано участие множественных форм протеасом, цитокинов и факторов обмена железа в развитии опухолей, иммунологической толерантности к ним, отдаленных системных нарушений при воспалении в раннем онтогенезе и адаптации к гипоксии для разработки диагностики трудно выявляемых типов рака, противоопухолевой терапии, способов коррекции негативного влияния воспаления в раннем развитии и регуляции устойчивости к гипоксии у млекопитающих; установлено, что цитозольный путь биосинтеза гема, активирующийся гипоксией, критически важен в реализации пластичности клеток эволюционно удаленных организмов; выяcнено, что в мезенхимальных стволовых клетках мыши при длительной культивации наблюдается существенное снижение активности протеасом; с использованием специфического ингибитора β5i субъединицы протеасом показано, что протеасомы с иммунными субъединицами играют важную роль в поддержании пролиферативного потенциала МСК. Кроме того показано, что баланс содержания АТФ и Mg2+ влияет на деградацию коротких флуорогенных субстратов 20S протеасомами. 9. В рамках изучения основ клеточного репрограммирования клеток различного происхождения в целях создания потенциальных клеточных терапевтических продуктов для онкологии, регуляции аутоиммунитета и метаболических синдромов: изучены особенности функционирования основных ферментативных путей, контролирующих редокс-гомеостаз изогенных клеток разного фенотипа в нормальных физиологических условиях и в условиях Н2О2-индуцированного стресса, моделирующего нарушение окислительного метаболизма в организме человека; получены лимбальные эпителиальные стволовые клетки в результате дифференцировки иПСК, а также мезенхимные стволовые клетки из стромы лимба; получены данные по трансплантации биоинженерной конструкции на основе амниотической мембраны и стволовых клеток слизистой нижней губы кролика на роговицу модельных животных, что имеет фундаментальное значение для понимания процессов, происходящих в тканях роговицы реципиента после трансплантации стволовых клеток в составе биоинженерных конструкций; разработана система записи транскрипционнной информации в клетках на основе подхода активации-модификации; определены пути изменения экспрессионных профилей, активации сигнальных путей и эпигенетических факторов с целью трансдифференцировки в направлении энтодермальных прогениторных клеток; разработан способ репрограммирования Сертоли-подобных клеток мышей в клетки Сертоли в культуре, которые можно будет использовать для поддержания искусственного сперматогенеза in vitro, а также для разработки новых методов терапии мужского бесплодия; проведено исследование фотометаболизма липофусциновых гранул и меланина в клетках ретинального пигментного эпителия и его роль в процессах старения, патогенеза и диагностики заболеваний сетчатки глаза. Уровень проведенных исследований не просто соответствует мировому уровню, а, однозначно, превосходит его, о чем свидельствует перечень опубликованных работ в высокорейтинговых журналах (Приложение 1). Все задачи проекта выполнены. НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПО ИТОГАМ ТРЕХ ЛЕТ РЕАЛИЗАЦИИ СОГЛАШЕНИЯ 1. Значимость полученных прорывных результатов с точки зрения науки, государства и общества и их важность для социально-экономической сферы страны В условиях ухудшения экологии, стрессовых и других неблагоприятных факторов (в частности, пандемии короновируса) возрастает негативное воздействие на здоровье граждан России. К числу первостепенных социально-значимых заболеваний относятся такие, как онкология, аутоиммунные заболевания, метаболические нарушения. Настоящий проект был посвящен изучению фундаментальных проблем клеточной биологии, связанных с социально-значимыми заболеваниями человека (опухолевая трансформация, аутоиммунные реакции, метаболические нарушения, дистрофические синдромы, обусловленные дефектами регенерации тканей), а также разработке инновационных подходов к диагностике и терапии этих патологий. Особый акцент был сделан на развитии новых медицинских технологий, основанных на методах клеточного ре-программирования и методах таргетной терапии онкологических заболеваний. Особенностью данного проекта было то, что эти многофакторные заболевания рассматривались в совокупности, именно поэтому данный проект представлял собой широкомасштабное, многоплановое и междисциплинарное исследование, благодаря чему все части проекта были тесно взаимосвязаны. В результате этого были получены прорывные результаты, которые важны как для фундаментальной науки, так и для социально-экономической сферы страны. Особо следует отметить, что ряд результатов был получен целиком и исключительно Российскими учеными и в Российской Федерации без привлечения иностранных ученых и технических возможностей зарубежных научных центров. Примером такого исследования является разработанная в ходе выполнения данного проекта новая парадигма доставки лекарств к метастатическим очагам (Zelepukin et al. Nat. Commun. 2022. 13 (1), 6910. doi: 10.1038/s41467-022-34718-3 IF 17.694), которая позволяет увеличить на порядок доставку цитостатиков к раковым очагам по сравнению с традиционными способами доставки, основанными на эффекте поглощения и удержания раковыми клетками. О прорывном характере данного исследования говорит то, что оно опубликовано в таком престижном журнале как Nature Communications 2. Ориентированность полученных результатов на наличие отраслевой потребности организаций реального сектора экономики в таких результатах Полученные результаты представляют собой продукты и технологии, которые будут востребованы производствами и компаниями реального сектора экономики, в том числе фармкомпаниями, занимающимися исследованиями и разработками новых иммунобиологических и клеточных препаратов. В результатах выполнения проекта проявила заинтересованность крупная фармкомпания ПАО «Фармсинтез». Разрабатываемые технологии скрининга на основе микрофлюидики, технологии онкотераностики позволяют вывести диагностику и терапию онкологических, аутоиммунных заболеваний и заболеваний, вызванных нарушением метаболизма, на новый уровень. Такие технологии будут реализованы в среднесрочной и долгосрочной перспективе и, безусловно, востребованы медицинскими учреждениями РФ. В проекте разработаны флуоресцентные сенсоры эпигенетических маркеров клеток человека и млекопитающих. Данные сенсоры потенциально могут быть ком-мерциализированы российской биотехнологической компанией Евроген (Москва; www.evrogen.ru), которая уже имеет в линейке своих продуктов целый ряд флуорес-центных меток и сенсоров. Полученные результаты проекта в полном объеме позволят решить ключевые проблемы клеточной биологии, а также инициировать и реализовать новые направления трансляционной медицины. Полученные при выполнении проекта результаты со-ответствуют мировому уровню исследований, а по некоторым направлением являются пионерскими. 3. Оценка научно-технического уровня полученных результатов проекта в сравнении с лучшими, в том числе зарубежными, достижениями в соответствующей области науки с указанием их измеримых (численных) характеристик Научно-технический уровень проведенных исследований соответствует мировому уровню, а по некоторым направлениям опережает его. Об этом однозначно свидетельствуют результаты исследований, опубликованных в самых высоко рейтиноговых профильных рецензируемых изданиях, таких как Proc. Natl. Acad. Sci. USA (IF 11.205), Nature Communications (IF 17.694), Chemical Engineering Journal (IF 13.273). 4. Оценка достижения целей, поставленных перед проектом с указанием вклада каждой организации-участника в достижении поставленных целей проекта Все поставленные перед проектом цели и задачи полностью выполнены, создан значительный задел для дальнейшего продвижения исследований, в том числе ориентированных на реальные запросы практической медицины и социально-экономической сферы страны. Проект представлял собой многоплановое комплексное исследование, все части которого были тесно взаимосвязаны. Именно в результате та-кого тесного взаимодействия членами Консорциума выполняемого проекта удалось получить столь значимые результаты. Так, в ИБХ РАН разработан модульный подход для CAR-T терапии с контролируемой цитотоксичностью на основе универсального Т-клеточного рецептора; для доставки лекарств к первичным солидным опухолям и метастазам на основе высокопористых наноконтейнеров, нагруженных химиопрепаратом, разработана принципиально новая концепция, основанная на мгновенном высвобождении лекарства из высокопористого носителя, способного быстро разрушаться в кровотоке; разработан фотоакустический метод детекции биодеградации наночастиц, необходимый при разработке и тестировании биодеградируемых материалов в клинических исследованиях; на основе разработанных авторами проекта генетически кодируемых флуоресцентных зондов создана первая в мире технология LiveMIEL для анализа изменений эпигенома в живых клетках в динамике и со сверхвысоким разрешением; создана методика, описывающая основные принципы по созданию технологии структурно-подкрепленного мембранного онкотаргетинга; определена молекулярная мишень мамбалгина-2 в опухолевых клетках; на основе полученных экспериментальных данных постулирован механизм формирования внутриопухолевой гетерогенности глиобластом, который связан с закислением микроокружения в процессе роста опухоли и возникновением изоформы специфичного белка, способствующей поддержанию более агрессивного мезенхимального фенотипа клеток глиобластомы. В Томском НИМЦ на основе метаболического репрограммирования разработан подход для создания модифицированных CD8+ Т-лимфоцитов крови здорового добровольца с высокой антиметастатической активностью в отношении стволовых опухолевых клеток; разработан «Протокол репрограммирования Т-лимфоцитов с использованием методов РНК-интерференции для лечения рака лёгкого». В ИНЦ РАН установлены сигнальные пути, запускаемые в раковой клетке при активации протон-чувствительных каналов; найдены модуляторы депо-управляемого входа кальция (Лефлуномид, Терифлуномид и 4-МРТС), подавляющие пролиферацию раковых клеток; изучен феномен «выживания» незначительной части опухолевой популяции после эффективной противоопухолевой терапии с помощью транскриптомного и протеомного анализа молекулярных сигнальных систем и компонентов везикулярного транспорта (экзосом) в сохранившихся опухолевых клетках; изучены особенности функционирования основных ферментативных путей, контролирующих редокс-гомеостаз изогенных клеток разного фенотипа в нормальных физиологических условиях и в условиях Н2О2-индуцированного стресса, моделирующего нарушение окислительного метаболизма в организме человека; получены лимбальные эпителиальные стволовые клетки в результате дифференцировки иПСК, а также мезенхимальные стволовые клетки из стромы лимба; получены данные по трансплантации биоинженерной конструкции на основе амниотической мембраны и стволовых клеток слизистой нижней губы кролика на роговицу модельных животных, что имеет фундаментальное значение для понимания процессов, происходящих в тканях роговицы реципиента после трансплантации стволовых клеток в составе биоинженерных конструкций; разработана система записи транскрипционной информации в клетках на основе подхода активации-модификации. В ИХБФМ СО РАН найдены новые ингибиторы фермента репарации ДНК тирозил-ДНК-фосфодиэстеразы 1 человека из различных классов природных соединений, которые могут быть применены для разработки препаратов, сенсибилизирующих действие противоракового препарата топотекана. В ИМБ РАН проведено изучение изменений активности протеасом в мезенхимальных стволовых клетках (МСК) мышей в зависимости от продолжительности культивации клеток после выделения; с использованием специфического ингибитора β5i субъединицы протеасом показано, что протеасомы с иммунными субъединицами играют важную роль в поддержании пролиферативного потенциала МСК; показано, что баланс содержания АТФ и Mg2+ влияет на деградацию коротких флуорогенных субстратов 20S протеасомами. В ИБГ РАН установлено, что ключевым моментом действия цитокина IL-2 на цитотоксическую активность Т лимфоцитов является генерация субпопуляции CD8+ CD25+клеток, несущих на цитоплазматической мембране белки, обусловливающие появление цитотоксической активности. Показано, что специфическое связывание лимфоцитов с клеткой-мишенью происходит благодаря стабилизации бинарного межклеточного комплекса, в результате чего происходит индукция цитотоксических сигналов программируемой клеточной смерти. В ИБР РАН определены пути изменения экспрессионных профилей, активации сигнальных путей и эпигенетических факторов с целью трансдифференцировки в направлении энтодермальных прогениторных клеток; создана in vitro система, позволяющая детектировать и изучать хромосомные аберрации сразу же после их образования, для выявления биомаркеров рака и особенностей развития опухолей на ранних стадиях заболевания; разработан способ репрограммирования Сертоли-подобных клеток мышей в клетки Сертоли в культуре, которые можно будет использовать для под-держания искусственного сперматогенеза in vitro, а также для разработки новых мето-дов терапии мужского бесплодия; создана in vitro платформа, позволяющая получать генетически модифицированные макрофаги (модМФ) из иПСК человека для изучения внутриклеточных механизмов регуляции про- и противовоспалительной активности фагоцитов, моделирования воспалительных заболеваний и разработки новых подходов к их терапии; исследовано участие множественных форм протеасом, цитокинов и факторов обмена железа в развитии опухолей, иммунологической толерантности к ним, отдаленных системных нарушений при воспалении в раннем онтогенезе и адаптации к гипоксии для разработки диагностики трудно выявляемых типов рака, противоопухолевой терапии, способов коррекции негативного влияния воспаления в раннем развитии и регуляции устойчивости к гипоксии у млекопитающих; проведено исследование фотометаболизма липофусциновых гранул и меланина в клетках ретинального пигментного эпителия и его роль в процессах старения, патогенеза и диагностики заболеваний сетчатки глаза. Результаты фундаментальных исследований, безусловно, будут способствовать здоровьесбережению, укреплению здравоохранительной системы Российской Федерации и решению задачи биобезопасности страны согласно приоритетным направлениям Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации 20в и 20д, соответственно. 5. Обоснованность понесенных затрат на реализацию проекта; Все затраты были произведены в строгом соответствии с конкретными целями исследования. 6. Рекомендации и предложения по использованию и дальнейшему развитию полученных результатов проекта. CAR-T терапия является в мире одним из самых перспективных и многообещающих направлений в терапии рака. В ведущих онкологических центрах мира она находит все более широкое применение. В то же время при использовании данного подхода могут развиваться такие серьезные побочные эффекты, как цитокиновый шторм, что может приводить к полиорганной недостаточности и летальному исходу. При выполнении данного проекта была предложена оригинальная методология, позволяющая избежать указанных недостатков. Она основана на авторском подходе, использующем модульную систему барназа-барстар, и позволяет контролировать такие параметры, как цитотоксичность терапии и дозозависимость. Модульность подхода позволяет с легкостью перенастраивать систему в соответствии с молекулярным профилем опухоли. Безусловно, данное направление целесообразно продолжать как в плане совершенствования технологии, так и проведения клинических испытаний. В частности, к разработанной технологии проявил интерес "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА". Письмо прилагается. Разработанные эпигенетические сенсоры могут быть применены в институтах РАН и университетах для изучения таких процессов, как опухолеобразование, эмбриональное развитие, дифференцировка клеток, старение клеток. Фармацевтические компании могут применять флуоресцентные эпигенетические сенсоры для широкомасштабных скринингов веществ, влияющих на эпигенетический статус хроматина, а также для выявления нежелательного влияния веществ-кандидатов на лекарственные препараты или косметические средства на эпигеном клеток человека. Следует отметить, что при выполнении работы 3 (заключительного) этапа по Соглашению №075-15-2020-773 были превышены все показатели результатов предоставления гранта, а именно (план/факт): количество статей по тематике проекта – 30/33; диссертации по результатам исследований – 12/16, доля аспирантов и молодых ученых до 39 лет – 51/54,97. В целом по проекту: количество статей по тематике проекта – 57/63; диссертации по результатам исследований – 14/19, доля аспирантов и молодых ученых до 39 лет – 51/54,32.