Биохимия нуклеиновых кислот как платформа создания средств терапии и диагностики социально значимых заболеваний

Важнейшей задачей федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями», утвержденной распоряжением Правительства Российской Федерации, является создание современных лекарственных препаратов и методов ранней диагностики заболеваний, наносящих обществу колоссальный ущерб. Общая цель проекта - проведение фундаментальных исследований, направленных на создание платформы для разработки средств диагностики и терапии социально значимых заболеваний на основе терапевтических нуклеиновых кислот нового поколения и средств их адресной доставки. Основными методами, примененными для решения задач в ходе выполнения проекта были следующие методы: твердофазный фосфитамидный синтез олигонуклеотидов и их модифицированных аналогов, пост-синтетическая модификация олигонуклеотидов, выделение суммарной РНК, выделение циркулирующих внеклеточных ДНК; ОТ-qПЦР; Вестерн-блот анализ, методы проточной цитофлуориметрии; конфокальная микроскопия; работа с эукариотическими клетками в условиях бокса; работа с экспериментальными моделями опухолей на лабораторных грызунах; в виварии; гистохимический и иммуногистохимический анализ, морфометрия, реконструирование генных ассоциативных сетей; анализ данных кДНК-микрочипирования; биоинформатический анализ с использованием различных баз данных, статистические методы обработки данных. В ходе выполнения проекта в 2021 были синтезированы и охарактеризованы несколько серий пептидил-олигонуклеотидных конъюгатов, в том числе и конъюгаты с модифицированной олигонуклеотидной частью. Показано, что частичная модификация олигонуклеотидной компоненты конъюгата значительному увеличению эффективности расщепления миРНК-мишени по сравнению с немодифицированным аналогом. Исследованы системы доставки ТНК в клетки и органы в составе конъюгатов с холестерином и в составе липоплесов с катионными липосомами. Показано, что присоединение холестерина к siРНК существенно увеличивает ее способность связываться с клетками крови. Показано, что биосовместимая липосомальная система. содержащая липоконъюгат фолиевой кислоты обеспечивает эффективное накопление siРНК в MDR+ опухолях и подавление роста ксенографтов опухолей у мышей линии SCID. Исследована способность искусственных везикул, полученных из клеток с помощью цитохалазина В (CINV), доставлять ТНК в эукариотические клетки. Показано, CINV, полученные из дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами, эффективно праймируют противоопухолевые Т-лимфоциты in vivo, и их эффективность сопоставима с эффективностью дендритно-клеточных вакцин. Проведен поиск опухолевых моделей для тестирования биологического действия ТНК. Показано, что в качестве таких моделей могут быть предложены опухолевые клетки пациентов с острыми лейкозами, выделенные из периферической крови или костного мозга. Выявлены сигнальные пути, активирующиеся в клетках-эффекторах под действием иммуностимулирующей исРНК. Показано, что исРНК реализует антипролиферативную активность и индукцию синтеза IL-6, действуя через активацию PKR и RIG-I. В ходе выполнения проекта в 2022 г были решены задачи, связанные с конструированием и синтезом конъюгатов, действующих на онкогенные микроРНК; получением генетических конструкций (кассет), способных эффективно проникать в различные типы клеток человека и экспрессировать в них ТНК для блокирования связанных с заболеваниями генов; создание на основе экзосом и сходных с ними везикулярных структур универсальных эффективных векторов для доставки ТНК в клетки; исследованием изменения состава и концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот при развитии опухолевого процесса и оценке влияния НК-расщепляющих ферментов, нормализующих эти показатели, на патогенез заболевания; исследованием влияния полусинтетических производных глицирретовой кислоты на изменение паттерна экспрессии генов в опухолевых клетках человека, выявление сигнальных путей, активирующихся под их действием, и идентификация молекулярных внутриклеточных мишеней производных. В ходе выполнения проекта в 2023 г проведено исследование влияния нуклеазоустойчивых олигонуклеотидов, содержащих N-(метансульфонил)фосфорамидные (µ-) модификации всех межнуклеотидных связей, адресованных к высоко онкогенным миРНК-21, миРНК-17 и миРНК-155, на выживаемость и пролиферативную активность опухолевых клеток различного гистогенеза. Выявлен модуль ключевых гиперэкспрессированных генов, вовлеченных в регуляцию острого воспаления кишечника (C3, Tyrobp, Mmp3, Mmp9, Timp1) и связанного с ним злокачественного перерождения тканей (Timp1, Adam8, Mmp7, Mmp13). Проведено исследование действия искусственных везикул, полученных путем обработки дендритных клеток, нагруженных опухолевой РНК, цитохалазином В и показано, что такие везикулы активируют иммунный противоопухолевый ответ. Были идентифицированы транскрипционные факторы, потенциально контролирующие экспрессию ряда генов, участвующих в развитии постгриппозной пневмонии в острую и подострую стадии. Описаны молекулярные механизмы развития пост-астматического фиброза и их ключевые компоненты. Определен противовоспалительный потенциал солоксолона на модели острого повреждения легких. Исследовано антипролиферативное действие иммуностимулирующей РНК (исРНК) в комплексах с P2000 PEG-содержащими и непегилированными катионными липосомами 2X3-DOPE на клетки меланомы В16 и лимфосаркомы RLS40. Разработана прогностическая шкала стратификации риска пациентов с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) на основе оценки чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. В ходе выполнения проекта в 2024 г. разработаны «коктейли» препаратов - микроРНК-направленных олигонуклеотидов, проявляющие значительную противоопухолевую активность. Эти препараты как в коктейле, так и по отдельности могут служить прототипами лекарственных средств и могут быть включены в программы доклинических и клинических исследований. Показано, что иммуносупрессия, развивающаяся в процессе химиотерапии опосредуется в значительной степени циклофосфамидом, поэтому для преодоления иммуносупрессии, вызванной стандартной полихимиотерапией необходима замена циклофосфамида в составе полихимиотерапии на другой цитостатик схожего механизма действия, который не будет индуцировать накопление в селезенке миелоидных супрессорных клеток. Определена перспективность использования искусственных микровезикулярных структур в качестве биосовместимого средства доставки терапевтических нуклеиновых кислот in vitro и in vivo. Показано, что с наибольшей эффективность такие везикулы доставляют в клетки антисмысловые олигонуклеотиды, в том числе и модифицированные, тогда как эффективность доставки плазмидной ДНК зависит от типа клеток реципиентов. Получены экспериментальные доказательства того, что гены (продукты генов) (Birc5, Cdca3, Plk1, Tpx2, Rrm2, Prc1, Nusap1, Mcm5, Top2a, Spag5), а также транскрипционный фактор E2f4, который является наиболее вероятным регулятором экспрессии данных генов, участвуют в развитии гиперпластических процессов в легких, являющихся следствием острого, в том числе и вирусного, воспаления. Эти гены (продукты генов) можно рассматривать как молекулярные маркеры и/или молекулярные мишени при развитии нежелательных гиперпластических изменений легочной ткани. Определен состав липосомальных композиций, обеспечивающие высокую противоопухолевую и противовирусную биологическую активность иммуностимулирующей РНК (исРНК) in vivo. Показано, что изменяя состав липосомальной композиции можно изменять паттерн экспрессии цитокинов, секреция которых индуцируется введением комплексов исРНК/липосомы. В целом, большинство результатов проекта получено впервые в мире. Все результаты опубликованы (см Приложение 1). Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на проблему дизайна ТНК и конъюгатов ТНК с каталитическим пептидом и транспортными молекулами, взаимодействие ТНК с клетками и механизмы, запускаемые ТНК в клетках. Полученные данные по искусственным везикулярным структурам являются пионерскими и открывают путь к переходу от клеточных к бесклеточным противоопухолевым вакцинам. Данные по анализу влияния состава липосомальных композиций на биологическую активность доставляемой ТНК могут быть применены для модулирования свойств ТНК in vivo. Полученные результаты проекта 2021 2024 гг. могут быть применены для создания универсальных конструкций на основе ген-направленных нуклеиновых кислот и векторов доставки, с помощью которых можно управлять такими патологическими состояниями как опухолевая прогрессия, развитие вирусной инфекции и иммуносупрессией. Полученные результаты доказывают перспективность данного направления исследований и открывают новые возможности для создания комплексных терапевтических подходов лечения неоплазий. Дальнейшее совершенствование конструкций терапевтических нуклеиновых кислот, направленных на повышения их терапевтической эффективности, оптимизация комбинированных подходов и создание средств их эффективной доставки in vivo создадут основу для получения высокоэффективных противоопухолевых препаратов нового поколения