Разработка отечественного инновационного тераностического препарата на основе изотопов тербия для проведения радиоиммунной терапии злокачественных новообразований различного гистологического типа

Ключевые слова: ЯДЕРНАЯ МЕДИЦИНА, ТЕРАНОСТИКА, ОПУХОЛИ, БИОМОДЕЛИРОВАНИЕ, ЭКСТРАКЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, Отчет представляет собой результаты, полученные при выполнении исследовательской программы проекта в 2022 году (этап 2). В рамках работ по первому этапу исследования были поставлены следующие задачи: Получение, разработка методов выделения и очистки, организация опытного производства радионуклида йод-124 для создания новых радиофармпрепаратов; Обработка облученных мишеней. Наработка изотопов иода-124; Разработка уникальных моноклональных антител - носителей для радионуклидов, высокоселективных к элементам опухоль-ассоциированной стромы; Отработка аналитических и препаративных процедур для работы с исходными биомолекулами, включая in vitro систему тестирования биологической специфичности биомолекул; Выбор бифункциональных хелатирующих агентов в отношении хелатирующей группы; Синтез хелатирующего производного на основе белков-пептидной молекулы, выделение и очистка для дальнейшей характеризации; Определение степени модификации полученного производного (масс-спектрометрия); Проверка сохранности биологической специфичности полученного производного; Проверка способности полученного производного образовывать устойчивый комплекс с радионуклидом; Проверка сохранности биологической специфичности полученного радионуклидного комплекса; Проверка устойчивости полученного радионуклидного комплекса по отношению к трансхелатированию с биологическими (сывороточный альбумин, плазма крови) и химическими (оксалат, цитрат, ЭДТА, ДТПА) хелаторами, проверка радиохимической стабильности комплекса; Наработка радиофармацевтических препаратов; Разработка и валидация моделей (тест-систем) онкологических заболеваний, патогенез которых максимально приближен к проявлениям наиболее актуальных новообразований и экспрессирующих целевые молекулы-мишени; Проверка работоспособности полученного комплекса in vivo, исследование динамики распределения радионуклида у здоровых животных и на моделях целевой патологии; Скрининг биораспределения молекул-носителей разрабатываемого радиофармацевтического препарата и прототипов радиофармацевтического препарата и их специфической фармакологической активности / функциональной пригодности; Исследование фармакокинетики молекул-носителей разрабатываемого радиофармацевтического препарата и прототипов радиофармацевтического препарата; Исследование общетоксического действия и токсикокинетики молекул-носителей разрабатываемого радиофармацевтического препарата и прототипов радиофармацевтического препарата; Исследование специфических видов токсичности молекул-носителей разрабатываемого радиофармацевтического препарата и прототипов радиофармацевтического препарата; Исследование специфической фармакологической активности / функциональной пригодности молекул-носителей разрабатываемого радиофармацевтического препарата и прототипов радиофармацевтического препарата; Обобщение и анализ доклинических исследований молекул-носителей разрабатываемого радиофармацевтического препарата и прототипов радиофармацевтического препарата. Проведение курса лекций по методам ядерной медицины в рамках дополнительного образования; Модернизация существующей основный образовательной программы магистратуры по направлениям 16.04.01 Техническая физика, путем создания двух модулей: ядерная медицина, технологии создания радиофармпрепаратов с включением нового разработанного курса. Поставленные задачи выполнены в полном объеме. Были разработаны, валидированы и апробированы в ходе экспериментов in vitro и in vivo модели первичных злокачественных новообразований головного мозга, опухолей толстой кишки, крови и кроветворных органов. В результате проведенных цитологических исследований получены основные характеристики клеточных линий, имеющихся в банке клеточных культур ОМРБ ПИЯФ. В результате проведенных работ по апробации на линиях клеток спектра методов тестирования терапевтических молекул выбраны оптимальные клеточные модели солидных опухолей человека и лабораторных животных для оценки цитотоксического действия радиофармпрепаратов, разрабатываемых в проекте. Проведенное исследование показало принципиальную возможность использования систем in vitro для сравнительной оценки цитотоксического действия РФП в целях определения их эффективности и рационального выбора рабочих концентраций и режимов инкубации. В ходе реализации научной программы разработки и получения уникальных антител - транспортных молекул с таргетным механизмом действия для радионкулидов тербия был разработан дизайн и получены антигены CTLA4, Stabilin-1 и VEGFR-1. Созданы по 2 экспрессионных эукариотических вектора на каждое кАТ (всего 6 векторов), содержащие гены тяжелой и легкой цепей кАТ. Проведены работы по анализу качества полученных генетических конструкций. Конструкции наработаны в количестве не менее 1 мг каждого вектора для временной трансфекции и получения кАТ в культуре эукариотических клеток HEK293. Проведена трансфекция и препаративная наработка рекомбинантных кАТ в культуре клеточной линии HEK293 в бессывороточной среде. Проведено выделение и очистка кАТ в количестве не менее 2 мг каждого антитела. Проведен контроль качества полученных антител с помощью биохимических и иммунологических in vitro методов. В результате работы из антигенов CTLA-4, STABILIN-1 и VEGFR-1 были обнаружены гибридомные клоны, продуцирующие антитела только к пептидному антигену CTLA-4. Из отобранных клонов, продуцирующих антитела к CTLA-4 были получены стабильные клоны клеток гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Гибридомные клетки трех клонов, специфичных для пептидного антигена CTLA-4 человека использовались для получения моноклональных антител. Полученные антитела были охарактеризованы ИФА. Из антигенов CTLA-4, STABILIN-1 и VEGFR-1 были обнаружены гибридомные клоны, продуцирующие антитела ко всем целевым антигенам. Из отобранных клонов, продуцирующих антитела к CTLA-4,STABILIN-1 и VEGFR-1 были получены стабильные клоны клеток гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. Гибридомные клетки 6 клонов, продуцирующие антитела специфичные к антигену VEGFR-1; 4 клонов, продуцирующие антитела специфичные к антигену CTLA4; 4 клонов, продуцирующие антитела специфичные к антигену STABILIN-1 использовали для получения моноклональных антител. Полученные антитела были охарактеризованы. С помощью метода биослойной интерферометрии (BLI).были изучены кинетические свойства связывания (константы ассоциации, диссоциации и аффинность) 14 антител, полученных в ходе выполнения Этапа 2 проекта (получение гибридом к рекомбинантным антигенам) с соответствующими человеческими антигенами (CTLA4, STABILIN1, VEGFR1). Дополнительно были изучены кинетические свойства связывания (константы ассоциации, диссоциации и аффинность) 8 антител, отобранных по результатам изучения кроссреактивности с мышиными антигенами с помощью ИФА, с мышиными антигенами (CTLA-4, STABILIN-1, VEGFR-1) и 3 контрольных антител (ипилимумаб, бексмарилимаб и икрукумаб) с мышиными и человеческими рекомбинантными антигенами. Используемые в эксперименте модели опухолевого роста – глиома крыс С6 и аденокарцинома толстой кишки мышей (АКАТОЛ) при эктопической субкутанной гетеротрансплантации животным обладают удовлетворительными темпами роста, достаточными для получения объективных данных по анализу влияния на развитие новообразований различных цитостатических препаратов и средств поддерживающей терапии. Развитие в организме мышей этих новообразований требует существенного ремоделирования перитуморальной области и опухолевой стромы, прежде всего за счет активации неоангиогенеза. Уровень экспрессии целевых антигенов (VEGFR1, CTLA-4 и Stabilin-1), против которых разрабатывается молекула-носитель радиофармацевтического препарата в тканях опухолей удовлетворительный. В рамках настоящего исследования была отработана процедура введения препарата 2фтор-2дезокси-глюкозы (18F-ФДГ) нормальным мышам и мышам с перевитой опухолью, с целью определения локализации опухолевых узлов в эксперименте in vivo. Была отработана процедура мечения антител радиоактивным изотопом 124I, проведено сравнение мечения радиоактивным изотопом 125I. Отработана процедура введения антител 8D1, меченных радиоактивным изотопом 124I и 125I, мышам линии BALB/c с перевитой опухолью SP2.0 при внутривенном введении и произведена оценка распределения антител в организме экспериментальных животных с целью исследовать биораспределение антител к неодетерминантам мембраносвязанного белка теплового шока 70. В рамках настоящего исследования была отработана процедура введения антител к VEGFR1 (7E7, 3B12), меченных радиоактивным изотопом 125I, мышам BALB/c Nude с перевитой опухолью C6 (крысиная глиома С6) и произведена оценка кинетических характеристик и биораспределения антител в организме экспериментальных животных в контрольных точках 3 часа и 24 часа. Результаты проведенного исследования указывают на отсутствие генотоксического действия разрабатываемого препарата «Моноклональное антитело анти-CTLA-4» в диапазоне тестируемых доз — 5 мг/кг и 50 мг/кг массы тела мышей. Продемонстрирован удовлетворительный профиль безопасности монотерапии глиомы С6 препаратом на основе моноклонального антитела к CTLA4 – не наблюдалось ускорения течения опухолевого процесса и/или развития системных токсических проявлений лечения. При этом эффективность монотерапии оказалась недостаточной. Прототип разрабатываемого таргетного радиофармацевтического препарата на основе моноклонального антитела против рецептора 1 типа сосудистого эндотелиального фактора — антиVEGFR1 и радиоактивного изотопа тербий-161 обладает самостоятельной противоопухолевой фармакологической активностью в отношении первичного новообразований головного мозга крыс — глиома С6, экспрессирующего целевой рецептор-мишень VEGFR1.