Наноструктурированные материалы для диагностики и терапии онкологических заболеваний

Цель работы – разработка мультимодальных систем адресной доставки лекарств с помощью наноконтейнеров, обеспечивающих функции одновременной диагностики и терапии онкологических заболеваний, управляемого высвобождения лекарственных средств, контроля миграции и биодеградации наноконтейнеров в организме, а также высокоточного мониторинга выхода лекарств из пор в условиях in vitro с применением неинвазивных методов. Задачи исследования: 1) Получение наночастиц кремния. Разработка методов осаждения золота в поры наночастиц. Активация фотолюминесцентных наночастиц. Характеризация наночастиц методами электронной микроскопии, динамического рассеяния света, рентгеновской дифракции, комбинационного рассеяния света, и пр. Измерение квантового выхода фотолюминесценции наночастиц. 2) Изучение стабильности и биодеградации наноконтейнеров в модельных биологических жидкостях (вода, фосфатно-солевой буфер (ФСБ), 23ºC и 37ºC). Определение влияния на биодеградацию наноконтейнеров таких параметров, как концентрация наночастиц, массовая доля золота, размер пор и наночастиц, наличие ионного обмена через диализный мешок (модель открытой системы). 3) Анализ цитотоксичности полученных нанокомпозитов в отношении раковых клеток в экспериментах in vitro, в том числе, в варианте пролонгированной (до 2-х недель) инкубации нанокомпозитов с клетками. 4) Разработка методов загрузки в нанокомпозитные частицы препаратов для терапии онкозаболеваний (доксорубицин, сунитиниб, паклитаксел, оксалиплатин). Измерение кинетики высвобождения лекарств из пор наночастиц в модельных биологических жидкостях (ФСБ, 37ºC) методами флуоресценции (для доксорубицина) или высокоэффективной жидкостной хроматографии (для всех типов лекарств). Результаты: 1) Отработаны методы получения наночастиц пористого кремния с использованием электрохимического или металл-стимулированного химического травления пластин кристаллического кремния. Разработан метод осаждения золота в поры наночастиц пористого кремния. Проведен анализ структурных и физико-химических свойств полученных наноматериалов с применением обширного набора методов. Показано, что получаемые наночастицы имеют размер около 100 нм и состоят из нанокристаллов кремния с порами размера около 10 нм. Показано, что процесс лиофильной сушки предотвращает глубокое окисление поверхности нанокристаллов кремния. Процесс воздушной сушки тех же наночастиц приводит к образованию поверхностного оксида примерно вдвое большей толщины с рыхло структурированным природным оксидом. Таким образом, различные условия сушки приводят к контролируемому тонкому и гибкому варьированию состава и структуры развитой поверхности пористых кремниевых наночастиц, а затем их атомной и электронной структуры. Разработана методика активация фотолюминесцентных свойств наночастиц, при этом квантовый выход их фотолюминесценции составил 5%. Показана возможность использования полученных наночастиц в качестве люминесцентных меток. 2) Изучена стабильность и биодеградация полученных наночастиц-наноконтейнеров в модельных биологических жидкостях. Показано, что растворение наночастиц в деионизованной воде происходит медленно по сравнению с растворением в ФСБ: в течение 14 дней инкубации в воде наночастиц фактически не растворялись. При концентрациях наночастиц в пределах диапазона цитотоксичности (до 400 мг/мл) массовая доля золота, размеры пор наночастиц и размеры наночастиц не оказывают существенного влияния на скорость их биодеградации. Вместе с тем, обнаружено, что наличие ионного обмена с внешней средой (модель открытой системы), задаваемого путем помещения наночастиц в диализный мешок, существенно ускоряло процесс их растворения из-за отсутствия насыщения раствора ионами кремниевой кислоты. 3) Проведен анализ цитотоксичности полученных нанокомпозитов в отношении раковых клеток в экспериментах in vitro, в том числе, в варианте пролонгированной (до 2-х недель) инкубации нанокомпозитов с клетками. Установлено, что суспензии кремниевых наночастиц не обладают заметной цитотоксичностью при концентрациях менее 400 мкг/мл, а повышение этой концентрации до 1 мг/мл приводит к гибели 50% клеток суспензионной линии К-562. На клетках линии аденокарциномы легкого A-549 при помощи Вестерн-блот анализа показано, что наночастицы в диапазоне концентраций 100-400 мкг/мл не вызывают гибель клеток или инициацию апоптоза клеток. 4) Разработаны методы загрузки доксорубицина и сунитиниба в поры наночастиц, а также получены специальные амфифильные наночастицы пористого кремния, оптимизированные для загрузки гидрофобного паклитаксела. Амфифильные наночастицы были получены с помощью последовательного формирования слоев перфорированного пористого кремния, окисления тетраборатом натрия, обработки в растворе пираньи, модификации поверхности триметоксиоктадецилсиланом и измельчения в планетарной мельнице. Измерение кинетики выхода доксорубицина из пор наноконтейнеров показало, что половина лекарства выходит в течение 8 часов, а более 95% – в течение 24 часов. Обнаружен замедленный выход сунитиниба из пор наноконтейнеров. С помощью метода люминесцентной конфокальной микроскопии доказано эффективное накопление наноконтейнеров в цитоплазме клеток за 24 часа инкубации. Показано, что пороги акустической кавитации в таких амфифильных наночастицах значительно снижены по сравнению с суспензией гидрофильных наночастиц и воды. Результаты ЯМР-анализа метаболитов крови крыс показали возможность кластеризации животных по группам с одинаковой степенью развития опухоли методом главных компонент. Метод главных компонент - технология многомерного статистического анализа, используемая для сокращения размерности пространства признаков с минимальной потерей полезной информации (ортогональное линейное преобразование, отображающее данные из исходного пространства признаков в новое пространство меньшей размерности). Анализировали концентрации 26 обнаруженных метаболитов крови, на основании которых методом главных компонент были проанализированы различия между двумя исследуемыми группами (группа здоровых крыс и крыс с опухолью).