Композитные наночастицы на основе диоксида кремния и золота для доставки лекарств и фототермической терапии

Объектом исследования являются наноструктуры, состоящие из золотых наночастиц, покрытых протравленной оболочкой из диоксида кремния. Цель работы – получение наноструктур на основе золотых наночастиц, покрытых оболочкой из диоксида кремния, и исследование их потенциала для доставки лекарств и фототермической терапии. В процессе работы были синтезированы золотые наночастицы разной формы. Золотые наностержни цилиндрической формы с полусферическими концами были получены методом зародышевого роста в коллоидном растворе. За счет изменения концентрации зародышей проводилась настройка плазмонного резонанса в рамках «окна прозрачности» биотканей. В частности, были получены образцы наностержней с плазмонным резонансом на 830 и 943 нм. Максимальная средняя длина синтезированных наностержней с полусферическими концами достигает 95±6.9 нм, а толщина 19.3±1.5 нм. При этом соотношение между максимумами в спектре достигало 7.76, что свидетельствует о достаточно высокой монодисперсности образцов. Получен коллоидный раствор золотых наноантенн. Они имеют относительно небольшой диаметр ядра и длинные узкие шипы. В частности, один из синтезированных образцов наноантенн имел следующие средние размеры: диаметр ядра 25±2.4 нм и длина шипов 71±5.8 нм. Обнаружено сильное влияние температуры реагентов на качество получаемых наноантенн. Так, использование при синтезе реактивов, охлажденных до 10 С, позволяло получить наноантенны более высокого качества, что подтверждалось данными спектрофотометрии и электронной микроскопии. Были также синтезированы золотые нанозвезды методом зародышевого роста в коллоидном растворе. Регулируя количества добавляемых реагентов (в первую очередь – зародышей), плазмонный резонанс нанозвезд мог настраиваться в пределах от 700 до 1000 нм. Было замечено, что при уменьшении количества добавленных зародышей с 400 до 150 мкл на 5 мл ростового раствора плазмонный резонанс сдвигался в сторону более длинных длин волн с 758 до 853 нм. При этом средняя длина шипов нанозвезд достигала 91.7±15.6 нм. На поверхности золотых наночастиц была синтезирована оболочка из диоксида кремния контролируемой толщины за счет гидролиза тетраэтилортосиликата в водно-спиртовой среде в присутствии гидроксида аммония. На поверхности золотых наностержней были получены оболочки со средней толщиной 11.4±1.4 нм, 14.8±2.4 нм и 21.8±2.8 нм. На поверхности золотых наноантенн была синтезирована оболочка из диоксида кремния со средней толщиной 25.8±2.3, 34.2±3.1 и 77.5±5.8 нм. Было обнаружено, что тонкая оболочка повторяла контур золотых наноантенн, полностью покрывая поверхность ядра и шипов. Золотые нанозвезды также были покрыты оболочкой из диоксида кремния со средней толщиной 8.2±1.3 и 25.1±6 нм. Было обнаружено, что при использовании данного метода с увеличением толщины оболочки происходит также увеличение количества свободных наночастиц диоксида кремния. Поэтому для синтеза более толстых оболочек был выбран другой метод, подразумевающий предварительное покрытие золотых наночастиц SH-PEG-COOH и последующее добавление 3-меркаптопропилтриметоксисилана и аммиака. С помощью данного метода были синтезированы 3 образца нанокомпозитов на основе золотых нанозвезд со средней толщиной оболочки из диоксида кремния 170±24.6, 90±10.2 и 28±3.5 нм. Спектрально формирование оболочки всегда сопровождается сдвигом плазмонного резонанса наночастиц в сторону более длинных длин волн и подъемом плеча в коротковолновой области спектра. Получены 3 образца нанокомпозитов с различной степенью протравленности оболочки из диоксида кремния, когда снижение оптической плотности составило 31, 50 и 61%. Степень протравленности оценивалась по снижению экстинкции на длине волны 600 нм относительно исходного спектра. Во время травления в спектре наблюдалось снижение интенсивности коротковолнового плеча, что свидетельствовало о снижении количества диоксида кремния, а также сдвиг плазмонного резонанса золотых наночастиц в сторону более коротких длин волн за счет изменения локального диэлектрического окружения наночастиц. Анализируя изображения, полученные на электронном микроскопе, можно заметить, что при снижении спектра на 50% у нанокомпозитов появляются более светлые области внутри оболочки, что свидетельствует о появлении полостей. При дальнейшем травлении происходит уменьшение количества диоксида кремния, что выражается в увеличении площади светлых участков на фотографиях, полученных на электронном микроскопе. В такие нанокомпозиты были загружены лекарственные препараты, такие как доцетаксел и доксорубицин. В зависимости от степени протравленности оболочки было загружено от 64.5 до 77.3 мкг/мл доцетаксела, что составило 32.23 и 38.65%, соответственно. Доксорубицин был загружен в концентрации от 95.74 до 106.25 мкг/мл, что составило 47.9 и 53.1%, соответственно. Концентрация загруженных лекарств определялась с использованием оптического метода. Было обнаружено, что без использования «молекулярного затвора» доксорубицин полностью выходит из загруженных наночастиц в раствор в течение 30 минут. Доцетаксел выходит из загруженных наночастиц менее чем за 4 часа. При использовании молекулярного «затвора», лекарственные препараты способны оставаться внутри нанокомпозитов в течение длительного времени. В частности, было продемонстрировано, что доцетаксел оставался внутри нанокомпозитов в течение 72 часов при комнатной температуре. Была продемонстрирована возможность запуска контролируемого выхода лекарства доцетаксела из нанокомпозитов путем нагревания раствора до 50С, что детектировалось спектрофотометрически по появлению характерного максимума поглощения в супернатанте. Исследована стабильность загруженных лекарством и покрытых тетрадеканолом композитов в различных средах: вода, физиологический раствор 0.9%, ТРИС-буфер (рН=8.5), ацетатный буфер (рН=4.6), среды DMEM и RPMI 1640 при инкубации в течение 3 дней. За все это время выход лекарства не происходил, следовательно, тетрадеканол позволял обеспечить высокую сохранность лекарства внутри нанокомпозитов при инкубации в разных средах и наносить дополнительное покрытие для повышения сохранности загруженного лекарства не требовалось. Также было обнаружено, что при оптимальных концентрациях нанокомпозитов, они не обладали токсическим эффектом как для здоровых, так и для опухолевых клеточных линий. Исследовано воздействия непрерывного лазерного облучения с длиной волны 808 нм на коллоиды нанокомпозитов и определены температурные показатели среды до и после воздействия. Для этого использовали два режима работы лазерного облучения: плотность мощности 60 мВт/см2 в течение 10 минут и плотность мощности 285 мВт/см2 в течение 10 минут. В первом случае происходил небольшой нагрев среды, который не вызовет гибель клеток от перегрева, однако может вызвать плавление тетрадеканола на поверхности нанокомпозитов и способствовать выходу лекарства, поэтому данный режим в дальнейшим использовали для лекарственного воздействия на культуры клеток. А во втором случае происходил сильный нагрев, который вызовет гибель клеток за счет гипертермии и, кроме того, локальный нагрев вблизи нанокомпозитов будет ещё выше. Поэтому этот режим использовали для фототермического и комбинированного воздействия на культуры клеток. Был исследован потенциал синтезированных нанокомпозитов для использования в биомедицине для химиотерапевтического и фототермического воздействия как по отдельности, так и в комбинации на опухолевые клеточные культуры. Загруженные доксорубицином композиты не проявляли токсических эффектов до тех пор, пока не были облучены низкоинтенсивным лазерным облучением. Это связано с тем, что при лазерном воздействии ядро нанокомпозита - наностержень нагревается и вызывает плавление слоя термочувствительного молекулярного «затвора» тетрадеканола. В результате этого загруженное лекарство выходит наружу, действует на клетки и вызывает снижение их метаболической активности, которое зависит от концентрации загруженного лекарства. При максимальной концентрации доксорубицина 10 мкг/мл метаболическая активность клеток снижалась примерно до 19%. В случае только фототермического воздействия использовали незагруженные нанокомпозиты и лазерное облучение. Здесь при облучении клеток лазером без внесения композитов метаболическая активность клеток максимально снижалась только до 77%. При использовании незагруженных нанокомпозитов и лазерного облучения метаболическая активность клеток максимально снижалась уже до 18%. При комбинации этих методов облучали лазером уже загруженные лекарством нанокомпозиты, чтобы спровоцировать сильный нагрев для выхода лекарства и гипертермии. Несмотря на то, что по отдельности химиотерапевтическое и фототермическое воздействия оказывают существенную гибель опухолевых клеток, в комбинации они усиливают эффекты друг друга и метаболическая активность клеток снижается до 8%.