Живые системы, медицинские технологии, медицинская химия и новые лекарственные средства по теме: Гибридные наночастицы магнетит-золото для исследования процессов доставки противоопухолевых препаратов (заключительный)

В ходе выполнения проекта синтезированы димерные наночастицы (НЧ) магнетит-золото и охарактеризованы методом просвечивающей электронной микроскопии, в том числе, высокого разрешения. НЧ магнетита имели ярко выраженную октаэдрическую форму с диагональю 25±5 нм, а НЧ золота – сферическую форму с диаметром 9±2 нм. НЧ были покрыты полимерной оболочкой из амфифильных полимеров DSPE-PEG/ Pluronic F127, после чего функционализованы флуоресцентным красителем Sulfo-Cy5, содержащим S-S фрагмент, селективно и ковалентно связывающийся с НЧ золота в составе димерной структуры. Разработана и оптимизирована методика селективной загрузки гидрофобного препарата нильского красного (Nile Red) и коммерческого противоопухолевого препарата доксорубицина (DOX), в полимерную оболочку на НЧ Fe3O4 и наличием сигнала как флуоресцентной метки, так и действующего вещества. Загрузка препаратов составляла 86 мкг Nile Red и 285 мкг DOX на 1000 мкг Fe3O4, соответственно. Подтверждено наличие рекордных МРТ-контрастных свойств НЧ c R2-релаксивностью 498,1 мМ-1с-1 и 276,9 мМ-1с-1 в воде и клетках 4Т1, соответственно. Токсичность НЧ была исследована in vitro на культурах клеток аденокарциномы молочной железы 4T1 и карциномы толстой кишки CT-26. Методом стандартного MTS-теста показано, что сами НЧ, связанные с флуоресцентной меткой Cy5, не оказывают токсического воздействия (выживаемость клеток более 90% по сравнению с контролем). Аналогичный результат был получен и NRed-НЧ-Cy5, что можно объяснить отсутствием цитотоксичности самого Nile Red как фотосенсибилизатора, активируемого лишь в присутствии внешнего излучения. Напротив, DOX-НЧ-Cy5 проявили дозозависимую токсичность как для клеток линии 4T1, так и для клеток линии CT-26 после 48 ч совместной инкубации, однако меньшую по сравнению со свободным DOX. Методом флуоресцентной микроскопии изучены процессы интернализации НЧ, DOX и Nile Red в клетках. НЧ с меткой Cy5 обнаруживаются в цитоплазме уже спустя 30 мин после добавления к клеткам, спустя 6 часов их количество увеличивается. Предположительно, механизмом захвата НЧ клетками является эндоцитоз. В случае интернализации НЧ, загруженных препаратами, наблюдалось постепенное увеличение интенсивности флуоресценции Nile Red/ DOX внутри клеток. В начальные моменты времени флуоресцентный сигнал Cy5 (соответствовал локализации НЧ) и флуоресцентные сигналы Nile Red/ DOX были ко-локализованы. С течением времени происходило высвобождение препаратов. Высвобождение DOX из НЧ вело к интенсивному накоплению препарата в ядре обоих типов клеток, возрастающему с течением времени. Таким образом, при инкубации в культуральной среде DOX-НЧ-Cy5 удерживают загруженный DOX до момента интернализации клетками с последующим высвобождением лекарственного средства при попадании НЧ в среду с низким рН (например, в эндолизосомы), после чего препарат попадает в ядро. Полученные данные свидетельствуют о том, что димерные НЧ магнетит-золото, покрытые полимерной оболочкой, могут быть использованы для доставки в клетки опухоли как гидрофильных, так и гидрофобных агентов. На следующем этапе проведено тестирование флуоресцентно меченых димерных НЧ магнетит-золото, загруженных препаратами (Nile Red, DOX) in vivo на моделях мышей породы BALB/c с подкожно привитой опухолью аденокарциномы молочной железы мыши 4T1. Методами флуоресцентной и интравитальной микроскопии показано, что НЧ стабильно циркулируют в кровеносных сосудах без признаков агрегации, как минимум, в течение первого часа после внутривенного введения, давая устойчивый флуоресцентный сигнал за счет метки Сy5. Методом ИВМ визуализирована экстравазация действующего вещества (Nile Red) в опухоли в режиме реального времени. Показано, что с момента введения и до момента интернализации НЧ в опухоли наблюдается колокализация флуоресцентных сигналов Cy5 и Nile Red, что говорит об устойчивости комплекса «НЧ-действующее вещество». Высвобождение Nile Red из НЧ в микроокружение опухоли удалось визуализировать в режиме реального времени - в течение 2 мин после прикрепления NRed-НЧ-Cy5 к стенке сосуда краситель диффундирует в окружающую сосуд опухолевую ткань. Спустя 6 ч после внутривенного введения NRed-НЧ-Cy5 флуоресцентные сигналы обоих красителей детектировались в опухоли, однако их ко-локализации не наблюдалось, вследствие высвобождения Nile Red с поверхности НЧ. Методами элементного анализа, спектроскопии поглощения, а также флуоресцентной микроскопии изучена фармакокинетка НЧ, загруженных DOX, в крови в течение суток после внутривенного введения. Показано, что количества как НЧ, так и действующего вещества, циркулирующих в кровотоке, практически постоянны в течение первого часа после инъекции как в плазме, так и в форменных элементах, снижается к 6 часу и не детектируется спустя сутки после инъекции (вследствие накопления в опухоли и захвата органами ретикулоэндотелиальной системы). Анализ соотношения DOX/ НЧ показывает, что оно лишь незначительно снижается по отношению к изначальному. Показано, что спустя 24 часа после внутривенного введения основное накопление НЧ происходит в печени, опухолях и селезенке, при этом за счет пассивного накопления вследствие EPR-эффекта 3 % от введенной дозы НЧ достигает опухоли. Данная величина в три раза выше, чем средний показатель эффективности для пассивной доставки НЧ в мировой литературе по данной проблеме. Дополнительно эффективность доставки и накопления НЧ в опухоли изучена при помощи магнитно-резонансной томографии до, а также спустя 30 мин, 6 ч и 24 ч после введения НЧ. Через 30 мин после инъекции НЧ накопление последних обнаружено, в основном, в печени, в более поздние моменты времени (6 ч и 24 ч) отчетливо наблюдается усиление контраста опухоли. Пик накопления НЧ в опухолях выявлен спустя 6 ч после введения, что также подтверждено данными IVIS. По результатам работы оптимизирована комбинация методов, дающая полную картину доставки НЧ в опухоли 4T1 и высвобождения действующего вещества in vivo. При этом система на основе димерных НЧ Fe3O4-Au, покрытых полимерной оболочкой DSPE-PEG, является оптимальной для доставки гидрофобных лекарств in vivo, удерживая загруженный препарат при циркуляции в кровотоке до момента интернализации в опухоли. В результате выполнения проекта полностью установлен сценарий поведения комплекса «наночастица-действующее вещество» от момента введения в организм до момента проникновения в опухоль. Для этого как как платформа для доставки использованы димерные наночастицы магнетит-золото, дающие уникальную возможность отслеживать судьбу как самого носителя (меченого флуоресцентным красителем Сy5 на наночастице золота), так и действующего вещества (противоопухолевого препарата доксорубицина или красителя нильского красного, являющегося моделью гидрофобного лекарства, которые также обладают флуоресцентными свойствами), которые было загружено в полимерную оболочку на поверхности наночастиц магнетита. Поскольку наночастицы и действующее вещество могут быть визуализированы независимо друг от друга, установлено, что наночастицы и загруженный на них препарат доходят до целевой (опухолевой) ткани в неизменном виде, высвобождения препарата в кровотоке не происходит. Показано, что при внутривенном введении комплекс "наночастица-действующее вещество" эффективно накапливается в опухоли (3% от введенной дозы), что превышает медианное (из литературы) значение для пассивной доставки. Таким образом, система на основе димерных НЧ Fe3O4-Au, покрытых полимерной оболочкой, является оптимальной для доставки гидрофобных лекарств in vivo, удерживающими загруженный препарат при циркуляции в кровотоке до момента интернализации в опухоли. Многообещающей перспективой в этом направлении является сочетание на НЧ молекул лекарств и низкомолекулярных лигандов с клеточным рецепторам (например, низкомолекулярных лигандов простат-специфического мембранного антигена, ПСМА), что в перспективе позволит использовать полученные биоконъюгаты для адресной доставки лекарств к конкретным клеткам.