Отчёт о научно-исследовательской работе «Совместное инкапсулирование препаратов в наночастицы как новая стратегия комбинированной терапии злокачественных новообразований молочной железы» (итоговый, этап 2)

Современные тенденции в подходах к лечению РМЖ связаны с использованием комбинированной терапии, направленной на ингибирование сразу нескольких путей образования и роста опухолевых клеток. На сегодняшний момент инкапсулирование веществ в матрицу носителя является эффективным подходом для улучшения профиля безопасности препарата. Снижению нежелательных эффектов также способствует тот факт, что препараты в носителе накапливаются специфично в органе-мишени за счет эффекта повышенной проницаемости и удерживания. В рамках выполнения данного проекта перед нами была поставлена задача получения наночастиц на основе PLGA-PEG с совместным инкапсулированием доксорубицина (DOX) и вориностата (SAHA) для лечения рака молочной железы. В данном проекте впервые было изучено оптимальное соотношение указанных препаратов и наночастиц, при котором будет наблюдаться синергизм в отношении широкой клеточной панели, затрагивающей большую часть подтипов РМЖ: HCC-1954, MCF-7/ADR, SKBR-3, MCF-7 и MDA-MB-231. С помощью математической модели Loewe и метода Чоу-Талалай был выявлен синергетический эффект комбинаций SAHA и DOX в отношении HER2-положительного подтипа опухолевых линий клеток: HCC-1954, MCF-7/ADR и SKBR-3, а также аддитивный эффект в отношении клеточных линий MCF-7 и MDA-MB-231. Для комбинации наночастиц синергетический эффект наблюдался в отношении клеточных линий SKBR-3 и MDA-MB-231, в самых низких разведениях в отношении клеток MCF-7 и MCF-7/ADR. На основе определенного индекса синергизма были выбраны соотношения SAHA/DOX (как для субстанций, так и для наночастиц) для каждого типа опухолевых клеток молочной железы, подтвержден их синергетический эффект с помощью метода Чоу-Талалай и рассчитано среднее оптимальное соотношение SAHA/DOX для всех клеточных моделей - 30:1. Полученная оптимальная комбинация препаратов SAHA/DOX (30:1) проявила высокую эффективность в отношении сфероидов HER2-положительных клеток SKBR-3 и MDA-MB-453, а в составе наночастиц в отношении сфероидов клеток SKBR-3. Корреляция между показателями синергизма и подтипами клеток свидетельствует о перспективности данного подхода для персонализированной терапии онкологических заболеваний. А совместное включение SAHA и DOX в полимерные частицы повышает эффективность препаратов как в отношении 2D, так и 3D культурах клеток HER2- положительного подтипа. Были получены наночастицы PLGA-PEG с совместным инкапсулированием доксорубицина и вориностата, были определены основные характеристики полученных наночастиц: средний диаметр 198 нм, ПДИ 0.151, дзета-потенциал -25 мВ. Была функционализирована поверхность наночастиц с помощью красителя Cy5.5. Разработку и оптимизацию метода получения наночастиц проводили с помощью планов Бокса-Бенкена. Была подтверждена сферическая форма полученных наночастиц с помощью метода просвечивающей электронной микроскопии. Для количественного анализа SAHA и DOX был разработан и валидирован метод ВЭЖХ, позволяющий одновременно анализировать оба соединения в наночастицах с совместным инкапсулированием. Была изучена кинетика высвобождения препаратов из наночастиц, показавшая быстрый скачок концентраций препаратов в первые 10 ч с последующим выходом на плато. Оценка способности разработанной комбинации препаратов (как индивидуально, так и в составе наночастиц) к образованию апоптотических популяций показала, что SAHA и DOX по отдельности способны стимулировать гибель клеток посредством апоптоза, инкубация клеток с SAHA-NP приводит к снижению ранних и поздних апоптотических популяций, а также к увеличению количества живых клеток по сравнению с DOX-NP и SAHA-DOX-NP. В свою очередь, SAHA-DOX-NP стимулировали больше апоптотических популяций, чем DOX-NP, что может свидетельствовать о наличии синергетического эффекта комбинации SAHA/DOX в наночастицах, а также указывать на смещение механизма гибели клеток в сторону апоптотического. Исследование интернализации наночастиц, содержащих SAHA и DOX, показало эффективное накопление наночастиц в клетках SKBR-3 после 24 ч инкубации. Определение гемолитической активности наночастиц доказало их гемосовместимость и возможность для безопасного внутривенного введения. Исследование острой токсичности показало низкую токсичность полученных наночастиц (более 2 г/кг). Противоопухолевая эффективность была исследована в отношении модели аденокарциномы молочной железы человека линии MDA-MB-231, привитой иммунодефицитным мышам линии BALB/с nude. DOX-SAHA-NP проявили наиболее выраженную противоопухолевую эффективность – объем опухоли значимо отличались от контрольной группы на 26, 29 и 33 день, а также значимо отличались от группы, получавшей смесь субстанций на 33 день (p<0,05). Биораспределение DOX-SAHA-Cy5.5-NP исследовали на мышах линии BALB/с nude, с привитой аденокарциномой молочной железы человека линии MDA-MB-231. Наиболее выраженное накопление наблюдалось в селезенке, печени и опухолевой ткани. Таким образом, полученные наночастицы проявляли высокую эффективность действия, низкую неспецифическую токсичность и селективное накопление в опухолевой ткани. Таким образом, все запланированные задачи проекта были выполнены в полном объеме.