Разработка универсальной системы диагностики опухолевых заболеваний на основе дендримеров и металлокомплексов редкоземельных металлов (промежуточный, этап 1)

Разработан метод получения высокомолекулярных контрастных агентов для использования в МРТ на основе полиамидоамидных дендримеров (PAMAM), производного 1,4,7,10-тетраазоциклодекан-1,4,7,10-тетрауксустной кислоты (DOTA) и диэтилентриамино-N,N,N”,N”-тетрауксусная кислота (DTPA) и векторных молекул для направленной доставки в опухолевые клетки: третьим доменом альфа-фетопротеина (r3dAFPpG), пептидом, способным взаимодействовать с рецептором альфа-фетопротеина GKQEFLING (KQ), рекомбинантным эпидермальным фактором роста человека (rEGF), и пептидом, способным взаимодействовать с рецептором эпидермального фактора роста HER1 YHWYGYTPQNVI (YH). Подобраны оптимальные методы модификации PAMAM дендримеров второго (G2), третьего (G3) и четвертого (G4) поколений производными DOTA, DTPA и NOTA и очистки полученных производных конъюгатов. Определено среднее количество DOTA, DTPA и NOTA, присоединенных к молекулам дендримеров методами ¹Н ЯМР и масс-спектроскопии. Показано, что к поверхности дендримеров G2 присоединялось в среднем 4 молекулы хелатора (DOTA, DTPA), к дендримерам G3 присоединилось в среднем 9 молекул хелатора, а к G4 – 19 молекул. Для снижения положительного заряда использован ангидрид янтарной кислоты. Подобраны оптимальный метод введения ионов Gd в состав модифицированных DOTA, DTPA дендримеров и методики очистки полученных соединений G(2-4)-DOTA(Gd) и G(2-4)-DTPA(Gd) от несвязавшегося избытка гадолиния путём внесения избытка этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующего диализа. Физико-химические показатели полученных производных: размер – методом динамического рассеивания света, заряд – методом электрофореза и содержание гадолиния – атомно-эмиссионной спектроскопией. Для комплексов G2-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) размер находился в диапазоне 2,5 - 2,8 нм, заряд от 11,3 ± 3,2 до -13,2 ± 3,4 мВ и содержание гадолиния 5,6% (мас. %) для G2-DOTA(Gd), 5,5% - для G2-DTPA(Gd). Для комплексов G3-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) размер находился в диапазоне 2,8 - 3,1 нм, заряд от -18,5 ± 6,5 до -19,3 ± 5,4 мВ и содержание гадолиния 9,2% для G3-DOTA(Gd), 9,4% для G3-DTPA(Gd). Для комплексов G4-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) размер находился в диапазоне 3,6 – 4,2 нм, заряд от -20,6 ± 5,7 до -22,1 ± 6,2 мВ и содержание гадолиния 17,4% для G3-DOTA(Gd), 17,6% для G3-DTPA(Gd). Сделаны выводы: комплексы дендримеров c DOTA и DTPA достаточно хорошо связывали Gd, однако связывание c DTPA проходило значительно быстрее. Наибольшие количества Gd связывали комплексы на основе дендримеров G3 и G4. В состав полученных комплексов вводили векторные молекулы (r3dAFPpG, пептида KQ, rEGF и пептида YH). Получены и испытаны два модельных конъюгата на основе вектора r3dAFPpG и доксорубицина. В качестве линкеров использованы CAA и SPDP-PDPH (линкерсодержащий S-S связь). Показано, что скорость гидролиза линкеров одинакова, однако при добавлении к культуре клеток или в присутствие лизосомального экстракта скорость гидролиза S-S-связи значительно возрастает. На основании полученных данных сделан вывод о нежелательности введения S-S-связи, несмотря на простоту данного метода (например, введение аминореактивного малеимида в состав дендримера) между вектором и дендримерами несущими Gd и предпочтительном использовании более лабильных сшивающих агентов. В дальнейшем для конъюгации векторных молекул и дендримеров использовали клик реагенты. Показано, что молярное соотношение дендримеров к вектору в конъюгатах rEGF-G(2-4)-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) составило 1:1, а в конъюгатах 3dAFPpG-G(2-4)-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) – 1:1.2. Продемонстрировано, что конъюгаты, содержащие векторные молекулы, селективно накапливались в опухолевых клетках линий A549, HeLa, SKOV3, MCF7, в отличие от G(2-4)-DOTA(Gd)/DTPA(Gd), при этом ни одни из них не оказывали значительного токсического действия in vitro. Контрольные дендримеры G3-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) и G4-DOTA(Gd)/DTPA(Gd), не модифицированные янтарным ангидридом и несущие положительный заряд, неспецифически взаимодействовали с мембранами клеток, повреждая их, вызывали увеличение популяций апоптических и некротических клеток. Показано, что цитотоксическая активность всех конъюгатов находилась на достаточно низком уровне (IC50 > 350 мкмоль•л⁻¹) в отношении клеток линий A549, MCF7 и SKOV3. Показано, что в присутствии ингибиторов клатрин и кавеолин-зависимого эндоцитоза поглощение конъюгатов, содержащих в составе rEGF и 3dAFPpG, происходило в большей степени за счет клатрин-зависимого эндоцитоза. В то же время интернализация отрицательно-заряженных G(2-4)-DOTA(Gd)/DTPA(Gd) конъюгатов происходила за счет кавеолин-зависимого эндоцитоза и макропиноцитоза. Предварительные in vivo-исследования выявили преимущественное накопление Gd в опухолевой ткани, а также частичное - в печени и селезенке, после введения конъюгатов rEGF-G4-DOTA(Gd), rEGF-G4-DTPA(Gd) и 3dAFPpG -G4-DTPA(Gd).