Природа компенсационного эффекта в кинетике денатурации белков

В отчетном году выполнены расчеты Кинетического Изотопного Эффекта (КИЭ) для диссоциации димеров полиглицина разной длины для изотопов водорода H/D, углерода 12C/13C, кислорода 16O/18O, и азота 14N/15N. Диссоциация димеров полиглицина на две мономерных цепочки является модельным процессом для разворачивания (unfolding) вторичной (третичной, …) структуры белков. Длина димера варьировалась в пределах N=1,16, где N- число звеньев, каждое из которых содержит две межцепочечные водородные связи 𝑁 - 𝐻 ⋯ 𝑂 = 𝐶 (H-связи), разрыв которых и приводит к диссоциации димера. В целом в димере есть 4 группы водородных связей, которые отличаются между собой расстоянием O---H и, соответственно, энергией H-связей, а значит и разным вкладом в кинетический изотопный эффект. Эти 4 группы: межцепочечные H-связи, внутренние и внешние внутрицепочечные в димере, идентичные две группы H-связей в мономерах. Мы анализировали два варианта изотопного замещения: 1)-замещение только в межцепочечных H-связях 𝑁 - 𝐻 ⋯ 𝑂 = 𝐶, и 2)-замещение во всех H-связях. КИЭ содержит два вклада: энтальпийный и энтропийный. Энтальпийный вклад определяется разностью энтальпий диссоциации димеров для изотопозамещенной и незамещенной молекул (усилением H-связи с участием тяжелого изотопа). Показано, что усиление водородной связи при замещении легкого изотопа на тяжелый убывает в ряду H/D≫(_^14)N/ (_^15)N>(_^16)O/(_^18)O>(_^12)C/(_^13)C . Рассчитанное увеличение энергии межцепочечной водородной связи δ_H^D (E_(H-bond)) на 51 кал/моль при H/D замещении существенно меньше величины для усиления ковалентной C-H связи δ_H^D (E_(C-H bond))1800 кал/моль (оценено нами по литературным данным для колебательных частот пары CH4(CH3D)). Но, уже при диссоциации самого длинного из рассматриваемых димеров (16 звеньев, 32 межцепочечных H-связей) интегральное увеличение энергии совокупности разрываемых H-связей становится сопоставимым с представленной величиной для ковалентной C-H связи, что должно приводить к значительным величинам КИЭ для диссоциации длинных цепочек H-связей. Была выполнена оценка влияния ангармонизма на величину усиления энергии водородной связи при H/D замещении (разность энтальпий разрыва межцепочечной водородной связи). Для этого было использовано то обстоятельство, что потенциал H-связи, как показывает анализ литературных данных для H-связи в простых системах, хорошо соответствует потенциалу Морзе, для которого связь энергии нулевых колебаний с характеристиками потенциала известна. Оцененная поправка на ангармонизм соответствует понижению разности энтальпий разрыва межцепочечной водородной связи при H/D замещении на примерно 10 %. Для расчета констант скорости диссоциации использовалась предложенная нами в первый год проекта модель «абсолютно рыхлого переходного состояния», которая позволяет рассчитать константу скорости диссоциации димера по теории переходного состояния. Были рассчитаны зависимости величины КИЭ от длины диссоциирующего димера при H/D замещении как для межцепочечных водородных связей, так и при замещении во всех H-связях. Результаты расчета показали, что изотопное замещение во внешних внутрицепочечных H-связях приводит к значениям КИЭ, сопоставимым с величинами, полученными для межцепочечных H-связей. Этот эффект обусловлен тем, что внешние H-связи в димере входят в состав 7-членных колец, а при диссоциации димеров они становятся элементами 5-членных колец в мономерной цепочке. Наши результаты и литературные данные указывают на то, что в 7-членном кольце H-связь короче и сильнее, что и приводит к большому влиянию замещения во внешних H-связях. Что касается величины КИЭ, то для самой длинной рассматриваемой цепочки (N=16, 32 межцепочечных H-связи) значение КИЭ при H/D замещении достигает величины около 60 (T=298.15 K). Полученные результаты для энтальпийного фактора позволяют оценивать зависимость КИЭ от температуры для димеров полиглицина произвольной длины. Так, например, КИЭ при H/D замещении в межцепочечных водородных связях при росте температуры от комнатной на 10 К для димера длиной N=16 уменьшается примерно на 10%. Возможности для количественного сопоставления с литературными данными ограничены, поскольку трудно определить особенности механизма денатурации белков (число разрываемых водородных связей в лимитирующей стадии), для которых есть экспериментальные данные по влиянию изотопного замещения. Тем не менее, некоторые сравнения возможны и указывают на реалистичность полученных оценок. Так, сравнение экспериментальных литературных данных по КИЭ10 (H/D замещение) для разворачивания петли полиглутаминовой кислоты с данными наших расчетов указывает на то, что при этом разрываются около 20 межцепочечных H-связей, что, по-видимому, близко к реальным значениям. Оценки КИЭ для изотопов других атомов (12C/13C, 16O/18O, и 14N/15N) можно сделать на основании полученных нами результатов для энтальпийного фактора. Так, данные для 14N/15N позволяют оценить КИЭ при таком замещении во всех водородных связях для самого длинного рассматриваемого нами димера (N=16) равным 1.16. Этот эффект (16%) сопоставим с наблюдавшимся экспериментально изотопным эффектом (10-20%) для скорости роста культур Escherichia coli, выращенных на средах, содержащих либо изотоп азота 14N либо 15N (Filiou et al., Proteomics, 2012, 12, 1–8). Также были выполнены вычисления изменения энтальпии диссоциации димеров и значения КИЭ для димеров разной длины при изотопном H/D замещении в рамках B3LYP-D3 расчета, который является вариантом DFT-D подходов, используемых для так называемой дисперсионной коррекции, что позволяет лучше учитывать ван-дер-ваальсово взаимодействие молекул в слабосвязанных комплексах. Оказалось, что на величину изотопного эффекта такая коррекция влияет слабо. Величина изотопного эффекта определяется силовой постоянной водородной связи, которая в большей степени определяется кулоновским взаимодействием, а не ван-дер-ваальсовым взаимодействием в паре 𝐻 ⋯ 𝑂. Ранее выполненные расчеты для простых систем с водородной связью, где ван-дер-ваальсово взаимодействие несущественно, показали, что использование дисперсионной коррекции для расчета энергии водородной связи не улучшает согласия между рассчитанными и референсными значениями энергии водородной связи (Boese. ChemPhysChem, 2015, 16, 978). Применительно к нашим результатам, отсутствие существенного влияния дисперсионной коррекции на величину рассчитываемого нами изотопного эффекта (изменение КИЭ не превышает 20% для самой длинной цепочки) показывает, что наличие ван-дер-ваальсова взаимодействия цепочек димера полиглицина очень слабо влияет на характеристики потенциала собственно водородной связи, что позволяет экстраполировать полученную зависимость КИЭ при разворачивании (unfolding) вторичной структуры и на белковые (полипептидные) цепочки с другой аминокислотной последовательностью.