Полногеномный поиск ассоциаций и моделирование генных сетей селекционно значимых признаков у нута (Cicer arietinum L.) (промежуточный)

На территории Кубанской опытной станции ВИР были собраны листья 309 генотипов нута: 3 диких образцов C. reticulatum, 3 культурных сортов, 3 староместных сортов и 288 генотипов потомства F4 от скрещивания ди-ких генотипов с одним из культурных сортов. Чистая геномная ДНК была выделена из всех генотипов. По своим характеристикам ДНК пригодна для дальнейшего приготовления библиотек бисульфитной конверсии и секве-нирования по технологии Illumina. ДНК, выделенная из 21 генотипа ‒ 3 диких образцов C. reticulatum, 3 культурных сортов, 3 староместных сор-тов, а также из 12 рекомбинантов F3 была использована для приготовле-ния библиотек для полногеномного бисульфитного секвенирования на ос-нове тагментации (TWGBS), и в настоящее время проводится секвенирова-ние этих библиотек. В Краснодарском крае (45° 18ˈ с.ш. и 40° 52ˈ в.д.) на КОС ВИР в 2019 г. проведено полевое фенотипирование 288 гибридов F4 культурного нута с дикими видами. Изучение проводилось 12 фенологическим, морфо-логическим и агрономическим признакам. Образцы сгруппированы в 20 групп, в пределах каждой из которых были гибриды, имеющие одного и того же дикого родителя. Группы содержали от 5 до 17 образцов. Пока-зана изменчивость признаков у всех гибридов и отличительные особенно-сти каждой группы. Выявлено значительное варьирование признаков, как в пределах образцов, так и в пределах групп образцов. Эта изменчивость особенно характерна для признаков структуры урожайности (высота рас-тения, масса 1000 семян, масса семян с делянки, высота прикрепления нижнего боба и др.). Морфологические признаки – окраска цветков и се-мян, форма куста у гибридов не отличались от таковых у диких форм. Проведен сравнительный анализ транскриптомов бутонов, листьев до за-цветания и листьев после зацветания у трех генотипов культурного нута C. arietinum, нечувствительного к фотопериоду мутанта ICCV96029 и четы-рех генотипов дикого нута C. reticulatum и C. echinospermum, выращенных при яровизации и без нее. Анализ транскрипционного ответа культурного нута на яровизацию показал, что наиболее сильно экспрессия генов разли-чается в листьях после зацветания и что в транскрипционный ответ на яро-визацию вовлечены гены сигнальных путей, связанных с ответом на абио-тический стресс, и в частности на холод. Главный вклад в различие тран-скриптомов листьев до зацветания у диких и культурных видов, по всей видимости, вносят сигнальные пути биосинтеза вторичных метаболитов и их транспорта. Наиболее значимая разница транскриптомов бутонов и ли-стьев после зацветания у диких видов и культурных сортов нута связана с канонической и неканоническими функциями фактора элонгации EF-1 alpha ‒ туннелированием аминоацил‒тРНК синтетазы, взаимодействием с цитоскелетом и участвием в апоптозе. Другие различия в транскриптомах листьев после зацветания у диких видов и культурных сортов, по‒видимому, также опосредованы процессами деградации белков. Нечув-ствительность к фотопериоду генотипа ICCV96029 обусловлена несколь-кими мутациями, из которых одна ‒ делеция в гене Caelf3a на 5 хромосо-ме, который ортологичeн гену elf3 Arabidopsis thaliana, кодирующему транскрипционный фактор, участвующий в сигнальном пути циркадного ритма (Ridge et al., 2017). Природа других мутаций в этом генотипе неиз-вестна. Мы показали, что различие транскриптомов у мутанта ICCV96029 с одной стороны и культурных образцов или C.echinospermum с другой, по всей видимости, имеет эпигенетическую природу. На основании выпол-ненного анализа сформирован список образцов для анализа метилирова-ния ДНК. На данном этапе Проекта мы провели предварительный экспе-римент по подготовке клубеньков нута к флуоресцентному окрашиванию мРНК in situ современным методом гибридизационной цепной реакции (Hybridization Chain Reaction, HCR) для выявления пространственной экс-прессии генов, ответственных за метилирование/деметилирование у дикого и культурного нута. Особенности клеточной стенки растений и зрелых клубеньков потребовали модификации метода HCR на этапе предвари-тельной подготовки тканей, к примеру, инфильтрация тканей на этапе фик-сации, дегидратации и инфильтрации парафином проводилась в вакуум-ном эксикаторе. Мы опробовали два метода фиксации, подготовили срезы и окрасили их гистологическими красителями, чтобы оценить, насколько данная технология позволяет сохранить морфологию клубенька. Результа-ты показали, что морфология клубеньков хорошо сохранилась, и на изоб-ражениях видны зоны меристемы, инфицирования/дифференцировки и фиксации азота. Таким образом, разработанную методологию можно ис-пользовать для получения срезов клубеньков и дальнейшего окрашивания методом HCR in situ.