Новые подходы к иммунотерапии и иммунодиагностике социально значимых заболеваний с использованием мультифункциональных гибридных белков и наноконструкций и направленной регуляции различных звеньев иммунной системы

ГИБРИДНЫЕ НАНОСРУКТУРЫ, РАДИОНУКЛИДНАЯ ДИАГНОСТИКА, АДРЕСНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ, HER2, ЛИПОСОМЫ, ПРЕТАРГЕТИНГ, ФОТОДИНАМИЧЕКАЯ ТЕРАПИЯ, ФОТОТЕРМИЧЕКАЯ ТЕРАПИЯ, ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК, ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ, АЛЛЕРГИЯ, ИММУНОТЕРАПИЯ, NK-КЛЕТКИ, Т-ЛИМФОЦИТЫ Объектом исследования являются: рекомбинантные белки и мультифункциональные гибридные наноконструкции для диагностики и терапии рака и других применений; NK-клетки человека, аллергические иммунные реакции. Целью исследования является разработка технологий получения соединений для высокоточной диагностики и эффективной терапии социально значимых заболеваний, в первую очередь, онкологических, а также разработка подходов к направленной регуляции различных звеньев иммунной системы человека. В ходе выполнения НИР получены следующие научные результаты: 1) На основе периодических золотых наноструктур (нанодотов) создан биосенсор - преобразователь Фурье, позволяющий достигать сверхвысокой чувствительности анализа соединений в биологических средах. Впервые в мире получены золотые наностержни GNR, покрытые опухолеспецифичным адресным модулем DARPin, которые находят опухолевые клетки определенного молекулярного профиля и подавляют их рост при облучении инфракрасным светом в «окне прозрачности биоткани»; полученные конъюгаты DARPin-GNR являются перспективными соединениями для адресной фототермической терапии HER2-положительных опухолей. Методом сайт-направленного пегилирования получены мультимерные scFv-фрагменты антител, специфично связывающие ганглиозид GD2. Для высокоточного распознавания опухолевых клеток с определенным молекулярным профилем (HER2+; EpCAM+) получены инновационные адресные пептиды DARPin соответствующей специфичности, способные селективно связываться с указанными опухолевыми маркерами. На основе сконструированных адресных пептидов и действующих агентов различной природы (радионуклиды, белковые токсины) сконструированы и исследованы новые гибридные наноразмерные структуры для терапии и диагностики рака с различными механизмами действия. Впервые показано, что опосредованная HER2-специфичным пептидом DARPin адресная доставка липосомной формы рибонуклеазы барназы к HER2- положительным раковым клеткам человека приводит к их селективному уничтожению. Показана возможность радионуклидной визуализации HER2/neu-позитивного рака молочной железы с использованием радиофармпрепарата на основе рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29. Получен новый тип тераностических комплексов на основе антистоксовых нанофосфоров, покрытых полиэтиленгликолем, и адресного токсина DARPin-LoPE, селективно уничтожающий клетки аденокарциномы молочной железы человека. Прошел I фазу клинических испытаний инновационный радиофармпрепарат, созданный на основе рекомбинантного адресного полипептида DARPin G3, для радионуклидной диагностики HER2-положительного рака молочной железы. Установлено, что блокировка системы мононуклеарных фагоцитов частицами-блокаторами увеличивает циркуляцию в кровотоке тераностических магнитных частиц. Используя неинвазивный подход прижизненного мониторинга деградации магнитных частиц в организме животного, проведено комплексное исследование долгосрочной судьбы магнитных частиц в зависимости от их изменяемых параметров. Для доставки лекарств к первичным солидным опухолям и метастазам на основе высокопористых наноконтейнеров, нагруженных химиопрепаратом, разработана принципиально новая концепция, основанная не на EPR-эффекте, а на мгновенном высвобождении лекарства из высокопористого носителя, способного быстро разрушаться в кровотоке. Разработана полностью генетически кодируемая система для фотодинамической терапии на основе биолюминесцентного резонансного переноса энергии. На основе биосовместимых сополимеров молочной и гликолевой кислот, PLGA, синтезированы наночастицы размером 200 нм, нагруженные фталоцианином магния, для фототермической терапии раковых клеток в инфракрасном диапазоне. Выполнена I фаза клинических исследований препаратов на основе искусственных белков неиммуноглобулиновой природы и технеция для радионуклидной диагностики рака молочной железы, характеризующегося гиперэкспрессией рецептора 2-го типа эпидермального фактора роста. В рамках разработки системы претаргетинга на основе супрамолекулярных белковых пар для лечения солидных опухолей создана и проанализирована система претаргетинга, нацеленная на молекулу адгезии эпителиальных клеток EpCAM, суперэкспрессия которой характерна для многих видов рака эпителиального происхождения. Продолжены работы по изучению механизмов, лежащих в основе фармакокинетики тераностических наноагентов. 2) На примере двух высокогомологичных флуоресцентных белков из Zoanthussp. определены аминокислотные остатки, участвующие в превращении белка с зеленой флуоресценцией (GFP) в красный флуоресцентный белок (RFP). Изучены превращения флуоресцентных белков в процессе созревания и фотоконверсии: показано, что в хромобелке из Actinia equina, как и в большинстве красных флуоресцентных белков, синтез хромофора проходит путем дегидратации и двух стадий окисления, однако на промежуточной стадии наблюдается появление дополнительной “зеленой” формы с максимумом поглощения в районе 530 нм. Исследованы фотофизические основы превращения нового фотоконвертируемого белка из Montastraea cavernosa: показано, что mcavGR обладает высокой яркостью, контрастностью фотопревращения и значительной фотостабильностью. Были получены генетически кодируемые гибридные конструкции флуоресцентного белка и пептида из бактериородопсина и исследована их эффективность связывания на клеточной линии HeLa при различных значениях pH. Эти данные свидетельствуют о том, что pHLIP может быть использован при разработке генетически кодируемых гибридных конструкций для адресной доставки высокомолекулярных диагностических/терапевтических препаратов в опухолевые клетки. Получены генетически кодируемые гибридные конструкции фототоксического белка miniSOG и пептида pHLIP и исследована их эффективность связывания на клеточной линии HeLa при различных значениях pH. Показано, что полученная конструкция miniSOG- pHLIP связывается с клетками и проявляет фототоксические свойства при значениях рН ниже 6,8. Получены белково-пептидные гибридные конструкции на основе рН-чувствительных пептидов и флуоресцирующих белков с дальнейшей целью тераностики онкологических заболеваний. Изучено влияние различных факторов, в том числе структуры пептидных линкеров, на функциональные свойства полученных конструкций. 3) Для направленной коррекции противоопухолевого иммунного ответа разработан эффективный способ получения клонов NK-клеток человека. С помощью ретровирусной трансдукции в NK-клетки включен ген hTERT, и доказано, что модифицированные клетки обладают повышенной активностью теломеразы. Изучена взаимосвязь фенотипических особенностей NK-клеток с их выживаемостью, экспансией и функциональной активностью; полученные данные продемонстрировали возможность получения, длительного культивирования и существенного наращивания клонов NK-клеток человека с сохранением их противоопухолевой активности, что имеет практическую значимость для применения этих цитотоксических эффекторов для клеточной иммунотерапии. Проанализированы фенотипические особенности и функциональная активность адаптивных NK-клеток, ассоциированных с цитомегаловирусной инфекцией, сопровождающей нейродегенеративные заболевания. Изучены механизмы развития гипериммунных реакций в специально разработанной мышиной модели низкодозовой аллергии. Использование данной модели позволило подробно охарактеризовать роль места и дозы введения антигена для индукции эффективного синтеза различных антител, а также локализацию продуцирующих антитела В-клеток. В мышиной модели показано, что формирование IgE и IgG продуцирующих В-клеток может происходить локально в месте введения аллергена. В мышиной модели воспаления дыхательных путей разработаны и опробированы подходы к 3D визуализации распределения флуоресцентно-меченных микрочастиц в легочных тканях мышей с помощью компьютерной обработки полученных на конфокальном микроскопе изображений этих органов. Проведено изучение механизмов функционирования мукозального иммунитета дыхательных путей, в том числе в условиях астмы и иммуносупрессии. Выполнены исследования механизмов патогенеза и разработка новых подходов к терапии аллергии I типа. Задачи проекта полностью выполнены. Результаты опубликованы в международных журналах, в том числе Q1, Q2 уровня и в российских научных журналах, входящих в базы данных WOSи Scopus.